Montering av vuxna Drosophila-hjärnor: En metod för att förbereda bilder för konfokal avbildning

Overview

Denna video beskriver en metod för montering av intakta hjärnor från vuxna flugor under en brobild och visar protokollet som utförs på immunostained hjärnor för fluorescerande mikroskopi.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Kelly et al., Dissekering och Immunofluorescent Staining of Mushroom Body och Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montering av vuxna D. melanogasterhjärnor på mikroskopbilder och bildbehandling

1. Bygg en "bridge"-bild. Placera två "bas" täcken ungefär 1 cm från varandra på en positivt laddad glidning. Se till att den positivt laddade sidan av bilden är vänd uppåt. Fäst täckglasen på bilden med nagellack enligt figur 1A. Det är vanligtvis till hjälp att försegla de tre ytterkanterna på varje baskåpa glida med nagellack för att säkerställa att monteringsmedierna inte vekar under dessa basskyddsslipsar. Låt nagellack torka helt (10 - 15 min) innan du fortsätter.
2. Placera bilden under stereomikroskopet och pipetten monteringsmedielösningen som innehåller de dissekerade hjärnorna i utrymmet mellan de två täckena. För att ge mer kontrast är det användbart att manövrera gåshudslamporna så att de är parallella med bänkskivan.
3. Ta bort extra monteringsmedia från bilden med en pipett, var försiktig så att du inte pipett hjärnan av bilden.
4. Wick bort extra monteringsmedia. Detta gör att hjärnorna kan placeras mer exakt under nästa steg.
5. Använd ett par tångar och stereomikroskopet, placera hjärnan på bilden i ett rutnätsmönster med antennloberna uppåt.
6. Placera en täckglimt ("bron") över hjärnan (figur 1A). Använd nagellack för att täta sidorna av brokåpans glid där de kommer i kontakt med "bas" -lockets glidningar.
7. Använd en p200-pipett och fyll långsamt mitthålan under bron med färska monteringsmedier (Figur 1B). Placera en droppe i taget på den öppna kanten av mittlocket och låt monteringsmedierna veke under mittbryggans locklip. Fortsätt tills hela håligheten är fylld med monteringsmedia och försegla sedan toppen och botten med klar nagellack.
8. När nagellacket är torrt, skjut bilderna omedelbart eller förvara i en ljustät snäv skjutbox vid -20 °C.
9. Inom en vecka, bild hjärnor med hjälp av en laser-scanning confocal mikroskop med excitation lasrar och filter kuber som är lämpliga för de valda fluorescerande sekundära antikroppar. Z-stack bilder av svamp kropp nervceller erhålls vanligtvis med hjälp av 20X eller 40X mål. Avbildning av retinal photoreceptor nervceller kan kräva högre förstoring.

Representative Results

Figur 1: Montering av hjärnor som förberedelse för immunofluorescensavbildning. (A) Hjärnor är monterade på SuperFrost Plus-diabilder med ett broskydd för att förhindra platta till hjärnan. Två "bas" täckslipsar följs på en Superfrost Plus positivt laddad bild med klar nagellack och dissekerade hjärnor placeras sedan på glidningen mellan dem. En tydlig "bro" täckslip placeras ovanför hjärnan och klibbas på basskyddet glider. B)När nagellacket har torkat är Vectashield långsamt rört under bron för att bevara fluorescensen hos den sekundära antikroppen. Klar nagellack används sedan för att försegla toppen och botten av "bro" täckspill. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666