安装成人 嗜血 性大脑：为共焦成像准备幻灯片的方法

Overview

这段视频描述了一种将成年苍蝇的完整大脑安装在桥滑梯下的方法，并展示了在荧光显微镜免疫受污染的大脑上执行的协议。

Protocol

本协议摘自Kelly等人的摘录，即蘑菇体的解剖和免疫荧光染色和成人 德罗索菲拉黑色素加斯特 大脑中的光感受神经元，J.Vis.Exp.（2017 年）。

1. 将成人 D. 黑色素加斯特 大脑安装到显微镜幻灯片和成像中

1. 构建"桥"滑梯。位置 2 "基地" 覆盖在带正电荷的幻灯片上相距约 1 厘米。确保滑梯的正电荷侧朝上。将盖片贴在幻灯片上，指甲抛光，如 图1A所示。通常有助于用指甲油密封每个底盖滑动的三个外缘，以确保安装介质不会在这些底盖滑下灯芯。让指甲抛光完全干燥（10 - 15分钟）之前继续。
2. 将幻灯片置于立体显微镜下，将装有解剖大脑的安装介质溶液放入两个盖片之间的空间中。为了提供更多的对比度，它是有用的操纵古塞内克灯，使他们与板凳顶部平行。
3. 使用移液器从滑梯上取下额外的安装介质，小心不要将大脑从滑梯上移开。
4. 消除额外的安装媒体。这将允许大脑在下一步更精确地定位。
5. 使用一对钳子和立体显微镜，将大脑定位在滑梯上，以网格模式，天线叶朝上。
6. 在大脑上放置盖片（"桥"）（图1A）。使用指甲抛光剂密封桥盖滑的两侧，他们接触"基地"盖滑。
7. 使用 p200 移液器，用新鲜安装介质（图 1B）缓慢地填充桥下的中心腔。将一滴一滴放在中心盖片的开放边缘，并允许安装介质在中心桥盖滑下灯芯。继续，直到整个腔充满安装介质，然后用清晰的指甲抛光密封顶部和底部。
8. 指甲抛光剂干燥后，立即将幻灯片映像或存放在 -20 °C 的防光紧滑梯盒中。
9. 在一周内，图像大脑使用激光扫描共焦显微镜与激发激光和过滤器立方体适合选定的荧光二次抗体。蘑菇体神经元的 Z 栈图像通常使用 20 倍或 40 倍的目标获得。视网膜光感受神经元的成像可能需要更高的放大倍数。

Representative Results

图1：安装大脑，为免疫荧光成像做准备。 （A） 大脑安装在带有桥盖的超级冻土加滑梯上，以防止大脑扁平化。两个"基础"盖片粘附在超冻土加正电荷滑梯上，带有清晰的指甲油，然后解剖后的大脑被放置在他们之间的滑梯上。一个清晰的"桥"盖滑被放置在大脑上方，并粘附在底盖滑。（B） 指甲抛光剂干燥后，在桥下慢慢吹管，以保持二次抗体的荧光。然后使用透明指甲抛光剂密封"桥"盖滑的顶部和底部。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666