Montering Voksen Drosophila Brains: En metode til at forberede slides til Confocal Imaging

Overview

Denne video beskriver en metode til montering intakt hjerner fra voksne fluer under en bro dias og viser protokollen udføres på immunostained hjerner for fluorescerende mikroskopi.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Kelly et al.,Dissektion og immunfluorescerende farvning af svampekrop og fotoreceptor neuroner i voksendrosophila melanogaster hjerner, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montering Voksen D. melanogaster Brains på mikroskop Slides og Imaging

1. Byg en "bro" dias. Placer to "base" coverslips ca. 1 cm fra hinanden på et positivt ladet dias. Sørg for, at den positivt ladede side af diaset vender op. Hold coverlips til diaset med neglelak som vist i figur 1A. Det er normalt nyttigt at forsegle de tre yderkanter af hver base dække slip med fingernegl polish for at sikre montering medier ikke væge under disse base dække glider. Lad fingerneglpolering tørre helt (10 - 15 minutter), før du fortsætter.
2. Placer rutsjebanen under stereomikroskopet, og pipetter den monteringsmedieløsning, der indeholder de dissekerede hjerner, ind i mellemrummet mellem de to coverlips. For at give mere kontrast er det nyttigt at manøvrere svanehalslysene, så de er parallelle med bordpladen.
3. Fjern ekstra monteringsmedier fra rutsjebanen ved hjælp af en pipette, og pas på ikke at pipette hjernen af rutsjebanen.
4. Wick væk ekstra montering medier. Dette vil gøre det muligt for hjerner at blive placeret mere præcist i løbet af det næste trin.
5. Brug et par pincet og stereomikroskopet til at placere hjernen på rutsjebanen i et gittermønster med antenneflipper vendt mod.
6. Placer en dækslet slip ("broen") over hjernen(Figur 1A). Brug fingernegl polish til at forsegle siderne af broen dække slip, hvor de kontakter "base" dække glider.
7. Ved hjælp af en p200 pipette, langsomt fylde midt hulrummet under broen med friske montering medier (Figur 1B). Placer en dråbe ad gangen på den åbne kant af den midterste coverlip og lad monteringsmediet væge under den midterste broovertræk. Fortsæt, indtil hele hulrummet er fyldt med monteringsmedier, og forsegl derefter toppen og bunden med klar neglelak.
8. Når neglelakken er tør, skal du straks forestille dig rutsjebanerne eller opbevare dem i en lyssikker, stram glidekasse ved -20 °C.
9. Inden for en uge, billedhjerner ved hjælp af en laser-scanning confocal mikroskop med excitation lasere og filter terninger passer til de valgte fluorescerende sekundære antistoffer. Z-stack billeder af champignon krop neuroner er typisk opnås ved hjælp af 20X eller 40X mål. Billeddannelse af nethinde fotoreceptor neuroner kan kræve højere forstørrelse.

Representative Results

Figur 1: Montering af hjerner som forberedelse til immunfluorescensbilleddannelse. (A) Hjerner er monteret på SuperFrost Plus-rutsjebaner med et brodæksel for at forhindre udfladning af hjernen. To "base" dække glider er overholdt en Superfrost Plus positivt ladede dias med klar fingernegl polish og dissekeret hjerner er derefter placeret på diaset mellem dem. En klar "bro" dække slip er placeret over hjernen og klæbede til basen dække glider. (B) Når neglelakken er tørret, pipetteres Vectashield langsomt under broen for at bevare det sekundære antistofs fluorescens. Klar fingernegl polish bruges derefter til at forsegle toppen og bunden af "bro" dække slip. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666