Overview
このビデオでは、好ましい物質の摂取後にハエの腹部着色を評価することによって異なる味の着色溶液に対する魅力または回避を測定するために使用される行動方法である味好みアッセイについて説明する。注目のプロトコルは、様々なショ糖濃度の溶液に対するハエの好みを測定するために使用される手順を示しています。
Protocol
このプロトコルは、バンテルとテシエ、大人のショウジョウバエのための味の好みアッセイ、J.Vis.Exp.(2016)からの抜粋です。
1. 飢餓
- 標準的なフライバイアルの底に18.2 MΩの水で綿球を飽和させることによってフライ飢餓バイアルを準備します。あるいは、同様に18.2 MΩの水でフィルター紙の小片を飽和させ、バイアル内の角度で配置します。
- CO2 パッドで約100匹の動物のセットにハエを収集し、準備されたバイアルにハエを追加します。
注: 最良の結果は、5日未満の動物で得られます。しかし、動物の正確な年齢は、時間の経過に伴う味の好みの変化を決定する実験変数として制御することができる。 - 綿ボールまたはフォームストッパーを使用して、バイアルを閉じて固定します。環境に配慮したインキュベーターにバイアルを置きます。温度を25°C、湿度を70%以上に保ちます。バイアルは24時間手つかずのままにしておきます。
2. 味の好みアッセイ
- テストと同じ日にアッセイのためにすべてのタスタントを準備します。
注: 使用される正確なタストタントは、尋ねられている実験的な質問によって異なります。以下は、このプロトコルで使用されるタストタントの例です。最適化については、セクション4を参照してください。- 100 mMスクロース溶液10μl、赤い食品着色の13 μl、18.2 MΩ水977μlを組み合わせて、コントロールタスタン(1 mMショ糖)を準備します。
- 100 mMスクロース溶液50μl、ブルーフード着色10μl、18.2MΩ水940μlを組み合わせて、実験用タスタン(5mMショ糖)を調製します。
- 以下の方法で調製された標準的な100ミリメートルx 15ミリメートルプラスチックシャーレを使用してアッセイチャンバーを作ります:
- 12時にプレートの端に最も近いコントロールタスタントを3滴、6時に別の3滴を配置します。ドロップ間隔が同じであることを確認します。
- プレートの端に最も近い実験タスタントの10μl滴を3時に3滴、9時にもう3滴置きます。ドロップ間隔が同じであることを確認します。
- 必要な数の複製について、手順 2.2.1 と 2.2.2 を繰り返します。
- 約100の飢えたハエの空1バイアルは、すべての動物を麻酔するのに十分な長さのCO2 パッドに飛ぶ(約10秒)。準備されたアッセイ室の真ん中に動物を磨き、皿のふたで覆います。
注: より長い期間のCO2 暴露は、回復時間を改善し、摂食行動との干渉を制限するために避けるべきである。氷への暴露(〜5分)は、限られた暴露から生じる可能性のあるCO2 行動効果を避けるために麻酔のために使用され得る。 - アッセイ室を不透明な段ボール箱に入れます。必ず、テスト対象の条件と遺伝子型を使用して、ボックスの外側にラベルを付けます。
- セットアップ全体(ステップ2.4から段ボール箱に含まれるアッセイチャンバー)を、湿度70%以上の25°Cインキュベーターに2時間置きます。
- すべてのレプリケートについて、手順 2.3 ~ 2.5 を繰り返します。
- 2時間後、定量の準備ができるまで、段ボール箱内に含まれるアッセイチャンバーを-20°Cの冷凍庫に直接入れます。
3. 味味の好みアッセイ定量化
- 単一のアッセイチャンバーを室温(約5分)まで温めます。
- 解剖顕微鏡の下で、ブラシまたは鉗子のペアを使用して、腹部の色に基づいて動物をグループ化する:赤、青、紫または透明(図1)。
- 各グループの動物数を記録します。透明な動物はアッセイに参加していないため、計算に含めないことを検討してください。
- 次のいずれかの式に従って、プリファレンス インデックスを計算します。
- 目的の実験タスタントが赤染料に添加された場合は、(N赤 + 0.5N紫)/(N赤 + Nブルー + Nパープル)を使用してください。
- 実験タスタントを青色染料に添加した場合は、式を(Nブルー + 0.5N紫)/(Nブルー + N赤 +Nパープル)に調整します。
- すべての実験条件と反復について、計算を繰り返します。
4. 味覚アッセイの最適化
- 次のように、食品着色料が味の評価結果に影響を与えないように、使用する食品着色指標の濃度を経験的に決定します。
- ステップ2.1で示されているように同じ塩基化合物(例えば 5 mMショ糖)を用いて4つのタストを調製するが、食品着色料を省略する。
- 1.3%の赤い食品着色料を味料の1つに加えます。各チューブの様々な濃度の青色の食品着色を持つ残りの3つの味料(例えば 0.6%、1%、1.3%)を作ります。
- 各タスタントペアのプロトコルステップ2.2~3.4を完了します:1.3%の赤と0.6%の青。1.3%の赤と1%の青と1.3%の赤対1.3%のブルー。
- 好み指数の平均値が 0 になるまで、異なる割合の青食品着色率でステップ 4.1.1-4.1.3 を繰り返します (図 2)。
注: 出発点として、1.3%の赤い食品着色と1%の青い食品着色が相まって、通常は良好な結果をもたらす。青食品着色料の満足のいく濃度を1.3%染料に一致させることができない場合、ステップ4.1.1〜4.1.3は、様々な濃度の赤色着色と青色食品着色の一定濃度で繰り返すことができます。 - 同じ最適化食品着色濃度でテストされるすべての条件を分析します。
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Representative Results
図1:味の好みのアッセイ結果。 腹部着色のバリエーションの例をいくつか示す。濃い赤色を摂取 (A).ライトレッド摂取(B).濃い青色の摂取(C).水色摂取 (D).紫色の腹部は、全体の着色が紫色(E)に見える場合、または腹部の異なる領域が赤(矢印)の部分と青(矢印)の別々の部分(F)を示すときに考慮されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:食品着色効果の制御 食べ物の着色を味に加えても動物の好みに影響を与えてはならない。赤い色素の一定の濃度を維持しながら青い染料の濃度を変化させることは、1.3%の赤から1.0%の青の最適な組み合わせを明らかにしました。これは、0.5 付近の優先インデックス値で示されます。値は標準偏差±平均値です。*p < 0.05, ***p < 0.001 両面学生のtテストから。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
