Overview
이 비디오는 선호하는 물질을 섭취한 후 플라이의 복부 색을 평가하여 맛이 다르게 맛을 주는 유색 솔루션으로 어트랙션 또는 회피를 측정하는 데 사용되는 행동 방법인 맛 선호도 분석법을 설명합니다. 이 기능을 갖춘 프로토콜은 다양한 자당 농도의 솔루션에 대한 파리의 선호도를 측정하는 데 사용되는 절차를 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 반텔과 테시에에서 발췌, 성인 Drosophila에대한 맛 선호 분석,J. Vis. Exp. (2016).
1화 기아
- 표준 플라이 바이알 의 바닥에 18.2 MΩ 물이있는 면공을 포화시켜 비행 기아 바이알을 준비하십시오. 또는 18.2MΩ 물로 작은 필터 용지 스트립을 포화시키고 유리병 내에서 비스듬히 배치합니다.
- CO2 패드에 ~ 100 마리의 동물 세트로 파리를 수집한 다음 파리를 준비 된 유리병에 추가하십시오.
참고: 최상의 결과는 5일 미만의 동물로 얻을 수 있습니다. 그러나, 동물의 정확한 나이는 시간이 지남에 따라 맛 선호도의 변화를 결정하기 위해 실험 변수로 제어 될 수있다. - 면공이나 폼 스토퍼를 사용하여 바이알을 닫습니다. 환경적으로 통제되는 인큐베이터에 유리병을 배치합니다. 온도를 25°C로 유지하고 습도를 70% 이상 유지합니다. 바이알을 24시간 동안 그대로 둡니다.
2. 맛 선호 분석
- 테스트와 같은 날에 분석할 모든 태스포를 준비합니다.
참고: 사용할 정확한 tastants는 묻는 실험적인 질문에 따라 달라집니다. 다음은 이 프로토콜에 사용되는 예제 tastants입니다. 최적화는 섹션 4를 참조하십시오.- 100mM 자당 용액 10μl, 붉은 음식 착색 13μl, 18.2MΩ 수의 977 μl을 결합하여 제어 태액(1mM 자당)을 준비합니다.
- 100mM 자당 용액 50μl, 청색식 착색 10μl, 18.2MΩ 수의 940 μl을 결합하여 실험용 태스트(5mM 자당)를 준비한다.
- 표준 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 분석 챔버를 다음과 같이 준비합니다.
- 12시에 플레이트 가장자리에서 가장 가까운 10 μl 컨트롤 타스트 3 방울을 놓고 6시에 3 방울을 떨어 뜨립니다. 방울 사이의 간격이 유사한지 확인합니다.
- 3시에 플레이트 가장자리에서 가장 가까운 실험용 태스트 10 μl 방울 3방울을 놓고 9시에 3방울을 떨어뜨립니다. 방울 사이의 간격이 유사한지 확인합니다.
- 원하는 만큼 복제할 수 있는 경우 2.2.1 및 2.2.2 단계를 반복합니다.
- 100마리의 굶주리고 있는 유리병1병은 모든 동물을 마취할 수 있을 만큼 충분히 긴 CO2 패드로 날아갑니다(약 10초). 준비된 분석 챔버의 중간에 동물을 브러시하고 접시 뚜껑으로 덮습니다.
참고: CO2 노출의 긴 기간은 복구 시간을 개선하고 공급 행동에 대한 간섭을 제한하기 위해 피해야한다. 얼음에 노출 (~5 분) 심지어 제한 된 노출에서 발생할 수 있는 CO2 행동 효과 피하기 위해 마취에 사용할 수 있습니다. - 불투명한 골판지 상자에 분석 챔버를 놓습니다. 검사 중인 상태와 유전자형으로 상자 의 외부에 레이블을 지정해야 합니다.
- 전체 설정(2.4단계에서 골판지 상자에 포함된 분석챔버)을 2시간 동안 70% 이상의 습도를 가진 25°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 모든 복제에 대해 2.3~2.5단계를 반복합니다.
- 2 시간 후, 여전히 골판지 상자에 포함 된 분석 챔버를 -20 °C 냉동고에 직접 배치하여 수량에 대비할 때까지 하십시오.
3. 맛 선호 분석 정량화
- 단일 분석 챔버를 실내 온도까지 따뜻하게 할 수 있도록 (약 5 분).
- 해부 현미경에서, 브러시 또는 집게 쌍을 사용하여, 그들의 복부의 색깔에 따라 동물을 그룹 : 빨간색, 파란색, 보라색 또는 선명(그림 1).
- 각 그룹에서 동물의 수를 기록합니다. 명확한 동물이 분석에 참여하지 않았기 때문에 계산에 포함되지 않은 것을 고려하십시오.
- 다음 방정식 중 하나에 따라 기본 설정 인덱스를 계산합니다.
- 실험적인 관심 분제가 적색 염료에 추가되면 사용(N빨간색 + 0.5N퍼플)/(N빨간색 + N블루 + N퍼플)을사용하십시오.
- 실험용 태슬이 파란색 염료에 추가되면 방정식을 조정합니다(N파란색 + 0.5N퍼플)/(N블루 + N빨간색 + N퍼플)로조정합니다.
- 모든 실험 조건 및 복제에 대한 계산을 반복합니다.
4. 맛 선호 분석의 최적화
- 경험적으로 사용 되는 식품 착색 지표의 농도 결정 그래서 음식 착색 맛 분석의 결과에 영향을 주지 않습니다., 다음과 같이:
- 2.1단계에서 나타난 바와 같이 동일한 염기화합물(예: 5mM 자당)을 사용하여 4개의 태스를 준비하지만 식품 착색을 생략한다.
- 1.3% 붉은 음식 착색을 맛볼 수 있습니다. 각튜브(예: 0.6%, 1%, 1.3%) 등 다양한 농도의 청색식품 착색으로 나머지 3개의 태액을 만드십시오.
- 전체 프로토콜 단계 2.2 ~ 3.4 각 태액 쌍에 대 한: 1.3% 빨간색 대 0.6% 블루; 1.3% 빨간색 대 1% 파란색 과 1.3% 빨간색 대 1.3% 블루.
- 반복 단계 4.1.1-4.1.3 청색 식품 착색의 다른 백분율로 기본 설정 지수평균0(그림 2).
참고: 출발점으로, 1.3% 붉은 음식 착색과 함께 1% 블루 푸드 착색은 일반적으로 좋은 결과를 산출합니다. 파란 식품 착색의 만족스러운 농도가 1.3%의 염료와 일치할 수 없는 경우, 4.1.1~4.1.3단계는 다양한 적색 농도와 청색식품 착색의 일정한 농도로 반복될 수 있다. - 동일한 최적화된 식품 착색 농도로 테스트할 모든 조건을 분석합니다.
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Representative Results
그림 1: 맛 취향 분석 결과. 복부 착색의 변이에 있는 몇몇 보기는 도시됩니다. 어두운 빨간 섭취(A). 라이트 레드 섭취(B). 다크 블루 섭취(C). 라이트 블루 섭취(D). 보라색 복부는 전체 착색이 보라색(E)으로나타나거나 복부의 뚜렷한 영역이 빨간색 (화살표 헤드) 및 파란색 (화살표)(F)의별도의 부분의 부분을 표시 할 때 고려됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 식품 착색 효과 제어. 맛에 음식 착색을 추가하면 동물의 취향에 영향을 미치지 않아야합니다. 적색 염료의 농도를 유지하면서 적색 염료의 농도를 변화시키면서 1.3% 빨간색에서 1.0%의 청색으로 최적의 조합을 나타냈다. 이는 0.5에 가까운 기본 설정 인덱스 값으로 표시됩니다. 값은 표준 편차 ± 평균입니다. * p < 0.05, ***p & 0.001 양면 학생의 t-테스트에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |