Overview
El embrión Drosophila está rodeado de membranas externas protectoras. Para obtener acceso al embrión, a menudo se elimina la coral ,la más externa de las membranas. Este video describe un método comúnmente utilizado de deschorionación usando hipoclorito de sodio. El protocolo de ejemplo demuestra el procedimiento mientras se emplean técnicas estériles necesarias para la cría de animales axeónicos o gnotobióticos.
Protocol
Este protocolo es un extracto de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Preparar jaulas para poner huevos
- Hacer platos de agar de jugo de uva mediante microwaving 100 ml de agua, 10 g de levadura de cerveza, 10 g de glucosa y 1 g de agar. Hierva 3 veces en el paso 1.1 y agregue 10 g de concentrado de jugo de uva congelado para aumentar la visibilidad de los huevos en el plato de agar.
- Cuando el agar se haya enfriado a 55 °C, vierta 20 ml en placas Petri de 100 mm y deje solidificar.
- Cubra la superficie de las placas de agar con una pasta de levadura mezclando levadura de 1 g de cerveza con agua de 15 g. Vierta la pasta de levadura en la placa del agar asegurándose de que la superficie esté cubierta, luego vierta el exceso, dejando un residuo de levadura delgado detrás. Si se utilizan varias placas, la pasta se puede verter secuencialmente en varias placas.
- Transfiera placas de agar al fondo de una jaula.
NOTA: Un recipiente de delicatessen de 32 oz es un buen sustituto de las jaulas de mosca acrílica.- Haga tapas para recipientes de delicatessen de 32 oz cortando un agujero en la parte superior y pegando una malla transpirable sobre el agujero con pegamento no tóxico. Si el pegamento es soluble en agua, prevenga la exposición al agua a la tapa.
- Transfiera 200-300 moscas al recipiente y cubra con tapa. Cubra el orificio protegido contra mallas con una tapa de placa Petri vacía para evitar la evaporación de la superficie del agar y agregue un papel tisú húmedo dentro de la tapa si lo desea. Incubar moscas a 25 °C durante la noche durante la noche durante 16-20 h.
2. Recoger huevos
- Prepare un tamiz para la recolección de huevos colocando malla de nylon en un casquillo de plástico.
- Para recuperar el plato con huevos, retire las moscas de la jaula transfiriéndolos a un recipiente vacío. Si las mismas moscas se utilizarán al día siguiente, transfiéralas inmediatamente a una nueva jaula que contenga un plato de agar recién levadurado de jugo de uva. Las moscas se pueden utilizar durante 3-5 días secuenciales
- Retire las moscas muertas del agar con un pincel limpio, teniendo cuidado de no romper el agar.
- Recoger los huevos enjuagando la placa de agar con agua destilada, cepillando suavemente los huevos de la superficie del agar, y vertiendo el purines sobre la malla. Repita 3-4 veces hasta que todos o la mayoría de los huevos hayan sido retirados de la placa de agar.
3. Desconorionar los huevos y transferir a la dieta estéril
- Prepare el gabinete de bioseguridad rociando el interior (incluidos los lados) con un 70% de etanol. Limpie la parte inferior con un tejido de laboratorio y esterilizar la capucha con luz UV durante ~15 min. Esterilizar todos los suministros no biológicos (tazas de muestras, pincel, fórceps, contenedor de residuos, 400 ml de agua esterilizada y 100 ml de hipoclorito sódico al rociar con etanol e inmediatamente colocar en el armario de bioseguridad. Esterilizar con luz UV durante 15 min.
- Comience el primero de 2 lavados de hipoclorito de sodio colocando el casquillo con los huevos en una taza de muestra de 120 ml u otro recipiente estéril. Vierta lentamente ~90 ml de solución hipoclorita sódica al 0,6% hasta que esté justo debajo de la llanta.
- Enjuague los huevos durante 2,5 minutos. Re-suspender periódicamente los huevos mediante el uso de fórceps para mover el casquillo hacia arriba y hacia abajo en la solución de hipoclorito.
- Transfiera el casquillo directamente a una segunda taza de espécimen, precargada con lejía de 90 ml, dentro del armario de bioseguridad.
- Repita el paso 3.3 dentro del armario de bioseguridad. Al final del segundo tratamiento con lejía, los huevos deben comenzar a adherirse a los lados del buje.
- Realice los pasos 3.7-3.8 en el gabinete de bioseguridad.
- Deseche la lejía y lave el casquillo con agua estéril 3 veces. Vuelva a suspender los huevos varias veces durante cada lavado moviendo el casquillo con fórceps. Al final del tercer lavado, la mayoría de los huevos deben estar unidos al lado del buje.
- Usando un pincel esterilizado en etanol, transfiera los huevos del lado del buje a la dieta estéril. Transfiera los huevos individualmente o en lotes pequeños. Aspirar a 30-50 huevos por vial. Deje las tapas sueltas para permitir que el oxígeno entre en el tubo.
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