النيل الأحمر تلطيخ من C. elegans: طريقة لتصور قطرات الدهون في الحيوانات الثابتة

Overview

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لتلطيخ الدهون في الديدان الثابتة بالكامل باستخدام صبغة النيل الحمراء.  لعرض الدهون المحايدة على وجه التحديد في قلب قطرات الدهون ، صور أطياف الانبعاثات الخضراء من elegans C. الملون.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من إسكورسيا وآخرون، تحديد كمي لوفرة الدهون وتقييم توزيع الدهون في Caenorhabditis elegans بواسطة النيل الأحمر والنفط الأحمر O Staining ، J. Vis. Exp. (2018).

1. النيل الأحمر (NR) تلطيخ الدهون

1. إعداد 5 ملغ / مل NR الأسهم الحل
   1. في زجاجة 500 مل، إضافة 100 ملغ من مسحوق NR إلى 200 مل من الأسيتون 100٪.
   2. تغطية زجاجة مع رقائق الألومنيوم لتجنب أي التعرض للضوء.
   3. قبل الاستخدام، يحرك الحل لمدة 2 ساعة في الظلام.
   4. للاستخدام على المدى الطويل، قم بتخزين محلول مخزون NR في زجاجة محكمة الإغلاق دون أي تعرض للضوء. مقياس NR الأسهم الحل وفقا لاحتياجات البحث. تأكد من استخدام نفس محلول المخزون عبر تجارب تلطيخ NR للحصول على نتائج تلطيخ وتصوير متسقة.
2. إعداد حل عمل NR
   1. لكل 1 مل من 40٪ ايزوبروبانول (v/v)، إضافة 6 ميكرولتر من NR الأسهم الحل.
   2. إعداد 600 ميكرولتر من NR حل العمل لكل عينة.
      ملاحظة: جعل NR جديدة حل العمل الحق قبل تلطيخ. اعتمادا على احتياجات NR حل الأسهم، واستخدام إما 15 مل أو 50 مل تخرج أنبوب مخروطي.
3. إعداد الديدان لتلطيخ الدهون NR
   1. تنمو الديدان إلى مرحلة L4 في وقت مبكر في 20 درجة مئوية على متوسط نمو النيماتودا (NGM) المصنف مع أواخر سجل OP50 E. القولونية.
   2. غسل الديدان قبالة لوحة مع 1 مل من المالحة 1x الفوسفات العازلة + 0.01٪ تريتون X-100 (PBST) الحل ووضع تعليق دودة في أنبوب الميكروفون 1.5 مل.
   3. الطرد المركزي الديدان في 560 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة supernatant وتكرار هذه الخطوة حتى يتم مسح كولاي من التعليق.
   4. إضافة 100 ميكرولتر من 40٪ ايزوبروبانول إلى بيليه دودة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
   5. الطرد المركزي الديدان في 560 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant دون تعطيل بيليه دودة.
      ملاحظة: استخدام كميات أكبر من PBST لغسل الديدان قبالة لوحات إذا كان استخدام لوحات أكبر أو تلطيخ المزيد من الديدان لكل لوحة. لا تغسل الديدان في PBST أكثر من 15 دقيقة قبل تثبيت العينة. إجراء يغسل إضافية إذا لم يتم مسح supernatant من البكتيريا. تنفيذ الحضانة في 40٪ isopropanol باستخدام نوتاتور أو الروك. مراقبة الأنابيب دائما للتأكد من حدوث هياج عينة كاملة.
4. تلطيخ الدهون مع NR
   1. في الظلام، إضافة 600 ميكرولتر من NR حل العمل إلى كل عينة. عكس الأنابيب ثلاث مرات وخلط تماما الديدان في حل NR.
   2. تدوير العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   3. بعد الحضانة ، والطرد المركزي الديدان في 560 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant.
   4. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني واحتضان العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة لإزالة وصمة عار NR الزائدة.
   5. طرد مركزي العينات في 560 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة جميع ما عدا ما يقرب من 50 ميكرولتر من supernatant.
      ملاحظة: NR الحضانة لا يتطلب التحريض. تسوية الديدان أمر شائع خلال هذه الخطوة.
5. إعداد الشرائح لتصوير المجهر
   1. Resuspend بيليه دودة في ما تبقى من supernatant.
   2. ضع 5 ميكرولتر من تعليق الدودة على شريحة المجهر ووضع غطاء على بعناية لتجنب محاصرة أي فقاعات الهواء.
   3. ختم غطاء مع طلاء الأظافر قبل تصوير الديدان.
   4. إعداد الشرائح زوجين فقط في وقت واحد. وهذا يضمن التصوير NR لا يزال ثابتا عبر العينات. نوعية الصور الملطخة NR يقلل بعد 6 ساعة. من الصعب ملاحظة قطرات الدهون المنفصلة وزيادة الفلورية الخلفية ، مما يتداخل مع اكتشاف إشارة NR.
6. تصوير الديدان الملطخة NR
   1. صورة الديدان في التكبير 5X لالتقاط العديد من الحيوانات في مجال الرؤية.
   2. قم بالتبديل إلى التكبير 10X للحصول على تقدير كمي أفضل للديدان الفردية.
   3. استخدم قناة FITC/GFP لتصوير الديدان الملطخة ب NR وتجربة أوقات التعرض المختلفة لتحديد الظروف المثلى للقياس الكمي.
   4. حفظ الملفات بتنسيق TIF لتجنب فقدان البيانات بسبب الضغط.
      ملاحظة: تتراوح أوقات التعرض النموذجية من 100-1000 مللي ثانية. وجود وقت التعرض الأمثل، واستخدامه لجميع العينات للحفاظ على اتساق التصوير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator