Test di paralisi indotta dal nuoto (SWIP): un metodo per quantificare la locomozione mediata dalla dopamina in C. elegans

Overview

Qui, introduciamo un saggio per misurare swip, un fenotipo comportamentale di C. elegans che si verifica durante un movimento vigoroso come il nuoto.  Il protocollo di esempio illustra sia gli approcci di analisi manuali che automatizzati.

Protocol

Il seguente protocollo è un estratto da Kudumala et al,Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. 

Swip

NOTA: Descriviamo il metodo manuale di valutazione dell'SWIP nei worm di tipo selvaggio trattati con AMPH. Discutiamo anche brevemente del tracciamento dei worm e dell'ulteriore analisi della cinetica dei worm utilizzando un tracker worm automatizzato e un software di tracciamento che sono stati precedentemente descritti da Hardaway et al.

1. Metodo manuale per testare l'SWIP
   1. Aliquota 40 μL di soluzione di saccarosio 200 mOsm/L con o senza 0,5 mM AMPH in una piastra spot di vetro. Sotto lo stereoscopio, raccogliere 8-10 vermi allo stadio tardo-L4 con una ciglia o un piccone di platino e immergere il piccone nella piastra contenente la soluzione fino a quando i vermi non si spostano dal piccone e nuotano nella soluzione. Si noti il numero di worm raccolti nel pozzo, avviare il timer, osservare e registrare il numero di worm che espongono SWIP a ogni minuto.
   2. Copiare i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di worm paralizzati dividendo il numero di worm paralizzati ad ogni minuto per il numero totale di worm testati durante il test e moltiplicare per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi software grafico e statistico e tracciare i dati con valori percentuali sull'asse Y e tempo sull'asse X utilizzando il formato grafico XY.
   3. Eseguire ANOVA a due tempi seguito da analisi post-hoc (ad esempio, Bonferroni post-test) per testare la significatività statistica tra controllo, gruppi AMPH e tempo di trattamento.
2. Analisi automatizzata dell'SWIP
   1. Eseguire analisi automatizzate su un singolo worm alla volta. Il protocollo per configurare la fotocamera, il software worm tracker e lo script per eseguire l'analisi del software di tracciamento sono descritti in dettaglio in Hardaway et al.
   2. In breve, posizionare una singola ermafrodita in fase L4 tardiva in una piastra spot di vetro utilizzando un piccone per ciglia, come descritto nel metodo manuale nella sezione 1.1.2. Registra i video di nuoto di un worm alla volta e usa il software di monitoraggio dei worm per calcolare la frequenza delle curve del corpo.
   3. Seguire lo script fornito con il software di tracciamento per ottenere la frequenza di thrashing del worm e generare mappe di calore dai dati di thrashing del worm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/