Svømmeindusert lammelse (SWIP) Analyse: En metode for å kvantifisere dopaminmediert bevegelse i C. elegans

Overview

Her introduserer vi en analyse for å måle SWIP, en atferdsmessig fenotype av C. elegans som oppstår under kraftig bevegelse som svømming.  Eksempelprotokollen drøfter både manuelle og automatiserte analysetilnærminger.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

MERK: Vi beskriver den manuelle metoden for å vurdere SWIP i wild-type ormer behandlet med AMPH. Vi diskuterer også kort sporing av ormer og videre analyse av ormekinetikk ved hjelp av en automatisert ormesporer og en sporingsprogramvare som tidligere ble beskrevet av Hardaway et al.

1. Manuell metode for å teste for SWIP
   1. Aliquot 40 μL 200 mOsm/L sukroseoppløsning enten med eller uten 0,5 mM AMPH i en glassflekkplate. Under stereoskopet velger du 8-10 sen-L4-scene ormer med øyenvippe eller platinaplukk og senk plukket i platen som inneholder løsningen til ormer beveger seg av plukket og svømmer inn i løsningen. Legg merke til antall ormer som er plukket inn i brønnen, start tidtakeren, observer og registrer antall ormer som viser SWIP ved hvert minuttmerke.
   2. Kopier rådataene til et regneark, og beregn prosentandelen av ormer som er lammet, ved å dele antall ormer lammet i hvert minutt med totalt antall ormer som er testet gjennom hele analysen, og multipliser med 100. Kopier prosentverdiene til en hvilken som helst graf- og statistisk programvare, og tegn dataene med prosentverdier på Y-aksen og -tiden på X-aksen ved hjelp av XY-diagramformatet.
   3. Utfør toveis ANOVA etterfulgt av post-hoc analyse (f.eks. Bonferroni post-test) for å teste for statistisk signifikans blant kontroll, AMPH-grupper og behandlingstidspunkt.
2. Automatisert analyse av SWIP
   1. Utfør automatisert analyse på en enkelt orm om gangen. Protokollen for å sette opp kamera, orm tracker programvare og skript for å kjøre sporing programvare analyse er beskrevet i detalj i Hardaway et al.
   2. Legg kort en enkelt sen L4-scene hermafroditt i en glassflekkplate ved hjelp av et øyenvippeplukk, som beskrevet i den manuelle metoden i avsnitt 1.1.2. Ta opp svømmevideoer av en orm på den tiden og bruk ormesporerprogramvaren til å beregne frekvensen av kroppsbøyninger.
   3. Følg skriptet som følger med sporingsprogramvaren for å få orm thrashing frekvens og for å generere varmekart fra ormen thrashing data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/