Microinjección de embriones de drosophila vivos: entrega temprana de reactivos al embrión en desarrollo

Overview

Este video describe cómo realizar microinyecciones que entregan reactivos en embriones drosophila vivos. Los investigadores pueden utilizar este método para introducir compuestos exógenos como ácidos nucleicos y proteínas durante las primeras etapas del desarrollo embrionario. El protocolo destacado demuestra cómo configurar y realizar el procedimiento de inyección de cualquier reactivo soluble, aquí, una proteína fluorescente para experimentos de imágenes en vivo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Brust-Mascher y Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. (2009).

Recetas:

Platos de jugo de uva:

• 5.5g de agar bacto

• 14,5 g de dextrosa o glucosa

• 7,15 g de sacarosa

• Concentrado de jugo de uva de 45 ml (100% jugo).

• 204,5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

Mezcle todos los ingredientes y el microondas hasta que hierva.
Añadir 2,8 ml de mezcla ácida (mezcla de ácido: ácido propioico de 20,9 ml, ácido fosfórico de 2,1 ml, 27 ml H₂0)

Mezcle y vierta sobre platos Petri de 35 mm. Deje solidificar a temperatura ambiente durante uno o dos días. Si las placas no se van a utilizar pronto, selle con parafilm y manténgalo a 4 °C (permita equilibrar a RT antes de usarlo).

Pasta de levadura:
Disolver alrededor de una cucharadita de levadura (Sigma YSC2, levadura de Saccharomyces cerevisiae tipo II) en agua para formar una pasta gruesa. Coloque una pequeña cantidad de esto en cada plato de jugo de uva justo antes de su uso.

Búfer de inyección:

• 150 mM K-Aspartato

• 10 mM K-fosfato

• Imidazol de 20 mM, pH 7,2

Pegamento de heptano:
Desenrolle la cinta pegajosa doble y colóquela en una botella de 100 ml, agregue unos 50 ml de heptano, selle la botella y la roca durante varios días. Cuando lo use, agregue el heptano si el pegamento es demasiado grueso.

Cámara de deshidratación:
Tome una placa Petri de 100 mm, coloque una parte de un plato de 35 mm en su interior para hacer una "mesa" y agregue drierita (sulfato de calcio anhidro) alrededor de ella para que la altura de Drierite no sea más alta que la "mesa" y la cubierta. La mancha de cubierta con embriones se colocará en esta "mesa" para la deshidratación antes de la inyección. Es una buena idea utilizar al menos algunos indicando Drierite y cambiarlo cuando ha cambiado de color.

protocolo:
Este protocolo se puede utilizar para la inyección de prácticamente cualquier reactivo soluble en el embrión sínctico Drosophila: Por ejemplo, una proteína fluorescente para la observación o un inhibidor de proteína objetivo o ambos.

1. Colección de embriones

1. Pon un nuevo plato de jugo de uva en la jaula.
2. Retire este plato después de una hora, esta es la primera colección del día y a menudo no es muy bueno. Se puede descartar.
3. Cambie la placa cada hora para seguir recolectando embriones durante una hora cada uno.

2. Preparación de coverslip

1. Coloque un control de cubierta de 50 x 22 mm en un lado de una diapositiva del microscopio. Tape las cuatro esquinas a la diapositiva para que no se mueva.
2. Usando un aplicador con puntas de algodón, coloque una capa de pegamento de heptano en una línea en la cubierta (el pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos segundos, de lo contrario añadir más heptano).
3. Coloque un trozo de cinta adhesiva doble en el tobogán hacia el lado de la cubierta.

3. Preparación de embriones

NOTA: Los embriones deben ser tomados en imágenes unas 2 horas después del inicio de la recolección, así que comience los siguientes pasos permitiendo tiempo suficiente para terminarlos dentro de este período de tiempo.

1. Con un cepillo humedecido recoge cuidadosamente los embriones de la placa de jugo de uva y colóquelos en cinta adhesiva doble en el tobogán.
2. Usando la parte externa de las pinzas, enrolle los embriones sobre la cinta adhesiva doble hasta que la coral (la membrana externa) se abra.
3. Recoge el embrión enrollándolo suavemente sobre la carrotina para que se pegue a la pinza y colóquelo en el pegamento de heptano en la cubierta con el lado largo del embrión paralelo al lado largo de la cubierta. Configure de 10 a 20 embriones en una fila.
4. Retire el control de cubiertas y colóquelo en la cámara de deshidratación durante 3 a 8 minutos (esto depende de la humedad de la habitación y la cantidad a inyectar).
5. Colóquelo en una cámara metálica con grasa de vacío.
6. Cubra los embriones con aceite de halocarbono 700 para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección.

4. Inyección de embriones

1. Encuentra los embriones bajo un objetivo de 16x.
2. Aleja los embriones y encuentra la aguja sin mover el plano focal.
3. Centra la aguja y muévela hacia arriba sin moverla en dirección x o y.
4. Si la aguja no está abierta, coloque el borde de la cubierta en el campo de visión, pero no donde estará la aguja, y baje la aguja al mismo plano focal. Mueva con mucho cuidado la tapa hasta que golpee la aguja y la abra suavemente. Si la aguja está abierta, vaya al paso 5. (Las agujas se pueden abrir con ácido fluorhídrico antes de llenarse).
5. Ponga los embriones a la vista (pero no donde estará la aguja), baje la aguja en el aceite y asegúrese de obtener buenas gotas líquidas de la aguja.
6. Mueva cuidadosamente pero constantemente el embrión a la aguja e inyecte una gota en el embrión y aleje el embrión. (O siga las instrucciones de su aparato de inyección).
7. Después de que todos los embriones han sido inyectados, están listos para la observación en un microscopio confocal.