ショ ウジョウバエ 胚の微小注射:開発中の胚への試薬の早期導入

Overview

このビデオでは、生きた ショウジョウバエ 胚に試薬を送り込むマイクロインジェクションの実行方法について説明します。研究者は、この方法を使用して、胚発生の初期段階で核酸やタンパク質などの外因性化合物を導入することができます。このプロトコルは、任意の可溶性試薬の注入手順を設定して実行する方法を示しています。

Protocol

このプロトコルは、Brust-MascherとScholeyからの抜粋です,ショウジョウバエメラノガスターのシンジチアル胚、J. Vis. Expでのミトーシスを研究するための微小インジェクション技術. (2009).

レシピ：

グレープジュースプレート:

• バクト寒天 5.5g

• 14.5 g デキストロースまたはグルコース

• 7.15 g スクロース

• 45 ml のブドウジュース濃縮液(100%ジュース)。

• 204.5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

すべての材料と電子レンジを沸騰させるまで混ぜます。
2.8 mlの酸ミックスを加える(酸ミックス:20.9mlプロピオン酸、2.1mlリン酸、27ml_H20)

35mmのペトリ皿に混ぜて注ぎます。室温で1、2日間固めます。プレートがすぐに使用されない場合は、パラフィルムで密封し、4°C(使用前にRTに平衡化することができます)に保ちます。

イーストペースト:
約1ティースプーンの酵母(Sigma YSC2、サッカロミセスセレビシエII型酵母)を水に溶かし、厚いペーストを形成します。使用直前に、各ブドウジュースプレートに少量を置きます。

注入の緩衝:

• 150 mM K-アスパラギンテ

• 10 mM K-リン酸

• 20 mM イミダゾール、 pH 7.2

ヘプタン接着剤:
ダブル粘着テープを展開し、100mlボトルに入れ、約50mlのヘプタンを加え、ボトルを密封し、数日間ロックします。使用する場合は、接着剤が厚すぎる場合はヘプタンを追加します。

脱水室:
100mmのペトリ皿を取り、35mm皿の一部を中に入れて「テーブル」を作り、その周りにグリエール(無水硫酸カルシウム)を加えて、グリエールの高さが「テーブル」とカバーよりも高くないようにします。胚を含むカバースリップは、注射前の脱水のためにこの「テーブル」の上に置かれます。Drierite を示す少なくともいくつかを使用して、色が変更されたときに変更することをお勧めします。

議定書：
このプロトコルは、ショウジョウバエの同期胚への事実上任意の可溶性試薬の注入に使用することができます:例えば、観察のための蛍光タンパク質または標的タンパク質阻害剤またはその両方のいずれか。

1. 胚コレクション

1. 新しいグレープジュースプレートをレイケージに置きます。
2. 1時間後にこのプレートを取り外し、これはその日の最初のコレクションであり、多くの場合、あまり良くないです。破棄できます。
3. 1時間ごとにプレートを交換して、胚を1時間収集し続けます。

2. カバースリップの準備

1. 顕微鏡スライドの片側に50 x 22mmのカバースリップを入れます。4 つのコーナーをスライドにテープで貼り付け、移動しません。
2. 綿製のチップアプリケーターを使用して、カバースリップの1行にヘプタン接着剤の1つの層を入れてください(接着剤は粘性ではなく、数秒で乾燥する必要があり、そうでなければヘプタンを追加します)。
3. スライドのカバースリップの側面に向かって、二重粘着テープを貼ります。

3. 胚の準備

注: 胚は収集開始から約2時間後に画像化する必要があるため、次の手順を開始して、この時間枠内でそれらを完了するのに十分な時間を確保します。

1. 湿らせたブラシで慎重にブドウジュースプレートから胚を拾い、スライド上の二重粘着性テープに置きます。
2. ピンセットの外側の部分を使用して、絨毛膜(外膜)が開くまで二重粘着テープの上に胚を転がします。
3. コリヨンの上にそっと転がして胚を拾い上げ、トゥイザーにくっついてカバースリップのヘプタン接着剤の上に置き、胚の長い側をカバースリップの長い側に平行に置きます。1つの行に10から20の胚を設定します。
4. カバースリップを取り外し、脱水室に3〜8分間置きます(これは部屋の湿度と注入する量によって異なります)。
5. 真空グリースで金属チャンバーの上に置きます。
6. 更なる脱水を避けるために、胚をハロカーボンオイル700で覆う。胚は注射の準備が整いました。

4. 胚注入

1. 16xの目的の下で胚を見つける。
2. 胚を離して移動し、焦点面を移動せずに針を見つけます。
3. 針を中央に配置し、x 方向または y 方向に移動せずに上に移動します。
4. 針が開いていない場合は、カバースリップの端を視野に入れ、針がどこにあるかは置かず、針を同じ焦点面に下げます。カバースリップが針に当たるまで慎重に動かし、そっと開きます。針が開いている場合は、ステップ 5 に進みます。(ニードルは充填前にフッ化水素酸で開くことができます。
5. 胚を視界に入れ(針がどこにあるかは見えない)、針を油に下げ、針から素敵な液体滴を得ることを確認します。
6. 慎重に、しかし着実に針に胚を移動し、胚に滴を注入し、胚を離れて移動します。(または、注射装置の指示に従ってください)。
7. すべての胚が注入された後、それらは共焦点顕微鏡で観察する準備ができている。