Mikroinjection af Levende Drosophila Embryoner: Tidlig levering af reagenser til udviklingslandene Embryo

Overview

Denne video beskriver, hvordan man udfører mikroinjections, der leverer reagenser i levende Drosophila embryoner. Forskere kan bruge denne metode til at indføre eksogene forbindelser som nukleinsyrer og proteiner i de tidlige stadier af embryoudvikling. Den fremhævede protokol viser, hvordan man opsætter og udfører proceduren for injektion af ethvert opløseligt reagens - her et fluorescerende protein til levende billeddannelseseksperimenter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Brust-Mascher og Scholey, Microinjection Teknikker til at studere Mitosis i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).

Opskrifter:

Plader af druesaft:

• 5,5 g bacto agar

• 14,5 g dextrose eller glucose

• 7,15 g saccharose

• 45 ml druesaftkoncentrat (100% saft).

• 204,5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

Bland alle ingredienser og mikrobølgeovn indtil kogning.
Tilsættes 2,8 ml syreblanding (syreblanding: 20,9 ml propionsyre, 2,1 ml fosforsyre, 27 ml H₂0)

Bland og hæld på 35 mm Petri retter. Lad størkne ved stuetemperatur i en eller to dage. Hvis pladerne ikke snart skal anvendes, forsegles med parafilm og holdes ved 4 °C (lad dem ekvilibrere til RT, før de tages i brug).

Gær pasta:
Opløs omkring en teskefuld gær (Sigma YSC2, gær fra Saccharomyces cerevisiae type II) i vand til at danne en tyk pasta. Placer en lille mængde af dette på hver druesaft plade lige før brug.

Sprøjtebuffer:

• 150 mM K-Aspartate

• 10 mM K-fosfat

• 20 mM imidazol, pH 7,2

Heptan lim:
Unroll dobbelt klæbebånd og sted i en 100ml flaske, tilsæt omkring 50ml heptane, forsegle flasken, og rock i flere dage. Når du bruger, tilsæt heptane, hvis limen er for tyk.

Dehydreringskammer:
Tag en 100 mm petriskål, læg en del af en 35 mm skål inde for at lave et "bord" og tilsæt drierit (vandfri calciumsulfat) omkring det, så højden af Drierite ikke er højere end "bordet" og dækslet. Coverlip med embryoner vil blive placeret på dette "bord" for dehydrering før injektion. Det er en god ide at bruge i det mindste nogle angiver Drierite og ændre det, når det har ændret farve.

Protokollen:
Denne protokol kan bruges til injektion af stort set ethvert opløseligt reagens i Drosophila syncytial embryo: For eksempel enten et fluorescerende protein til observation eller en målproteinhæmmer eller begge dele.

1. Indsamling af embryoner

1. Sæt en ny druesaftplade på lægburet.
2. Fjern denne plade efter en time, dette er dagens første samling og er ofte ikke særlig god. Det kan kasseres.
3. Skift pladen hver time for at fortsætte med at indsamle embryoner i en time hver.

2. Tilberedning af coverslip

1. Sæt en 50 x 22mm coverlip på den ene side af et mikroskop dias. Tape de fire hjørner til diaset, så det ikke bevæger sig.
2. Ved hjælp af en bomuld tippet applikator, sætte et lag af heptane lim i en linje på coverlip (limen bør ikke være tyktflydende og bør tørre i et par sekunder, ellers tilføje mere heptane).
3. Sæt et stykke dobbelt klæbebånd på diaset mod siden af coverlip.

3. Embryonpræparat

BEMÆRK: Embryoner skal afbildes ca. 2 timer efter indsamlingens start, så begynd følgende trin, der giver tilstrækkelig tid til at afslutte dem inden for denne tidsramme.

1. Med en fugtet børste skal du forsigtigt hente embryonerne fra druesaftpladen og placere på dobbelt klæbende tape på diaset.
2. Brug den ydre del af pincet, rul embryonerne over det dobbelte klæbende tape, indtil chorion (den ydre membran) bryder op.
3. Pick up embryoet ved forsigtigt at rulle det over chorion, så det klæber til pincet og læg det på heptane lim på coverlip med den lange side af embryoet parallelt med den lange side af coverlip. Sæt 10 til 20 embryoner op i én række.
4. Fjern coverlip og læg det i dehydreringskammeret i 3 til 8 minutter (dette afhænger af rummets fugtighed og mængden, der skal injiceres).
5. Placer på et metalkammer med vakuumfedt.
6. Dæk embryonerne med halocarbonolie 700 for at undgå yderligere dehydrering. Embryonerne er nu klar til injektion.

4. Injektion af embryoner

1. Find embryonerne under et 16x mål.
2. Flyt embryonerne væk, og find nålen uden at flytte brændplanet.
3. Centrer nålen og flyt den op uden at flytte den i x- eller y-retning.
4. Hvis nålen ikke er åben, skal du sætte kanten af coverlip i synsfeltet, men ikke hvor nålen vil være, og sænk nålen til samme brændplan. Flyt meget forsigtigt coverlip, indtil den rammer nålen og forsigtigt bryder den op. Hvis nålen er åben, skal du gå til trin 5. (Nåle kan åbnes med flussyre før påfyldning).
5. Sæt embryonerne i betragtning (men ikke hvor nålen vil være), sænk nålen i olien og sørg for at få pæne væskedråber fra nålen.
6. Forsigtigt, men støt flytte embryoet ind i nålen og injicere en dråbe ind i embryoet og flytte embryoet væk. (Eller følg instruktionerne på injektionsapparatet).
7. Efter at alle embryoner er blevet injiceret, er de klar til observation på et konfokalt mikroskop.