الميكروبيكشن من الأجنة الدروزوفيلا الحية: الولادة المبكرة للكواشف إلى الجنين النامي

Overview

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء عمليات الشفط الدقيق التي توصل الكواشف إلى أجنة دروسوفيلا الحية. يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لإدخال مركبات خارجية مثل الأحماض النووية والبروتينات خلال المراحل المبكرة من نمو الجنين. يوضح البروتوكول المميز كيفية إعداد وإجراء إجراء حقن أي كاشف قابل للذوبان - هنا ، وهو بروتين فلوري لتجارب التصوير الحي.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من بروست ماشر وشولي، تقنيات microinjection لدراسة ميتوسيس في الجنين التزامن Melanogaster Drosophila ، J. Vis. Exp. (2009).

الوصفات:

أطباق عصير العنب:

• 5.5 غ باكتو أغار

• 14.5 غ من الدكستروز أو الجلوكوز

• 7.15 غ سكروز

• 45 مل عصير العنب التركيز (عصير 100٪).

• 204.5 مل H₂0

• 625 ميكرولتر 10N ناوه

تخلط جميع المكونات والميكروويف حتى يغلي.
إضافة مزيج حمض 2.8 مل (مزيج حمض: 20.9 مل حمض البروبيونيك، 2.1 مل حمض الفوسفوريك، 27 مل H₂0)

تخلط وتسكب على أطباق بيتري 35 ملم. السماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم أو يومين. إذا كانت لوحات لن تستخدم قريبا، ختم مع بارا فيلم والحفاظ على 4 درجة مئوية (السماح لتوازن إلى RT قبل استخدام).

معجون الخميرة:
حل حوالي ملعقة صغيرة واحدة من الخميرة (سيغما YSC2، الخميرة من Saccharomyces cerevisiae النوع الثاني) في الماء لتشكيل عجينة سميكة. وضع كمية صغيرة من هذا على كل لوحة عصير العنب فقط قبل الاستخدام.

المخزن المؤقت للحقن:

• 150 mM ك-أسبارتات

• 10 mM ك فوسفات

• 20 مليون إيميدازول، رقم الحموضة 7.2

الغراء الهيبتان:
Unroll الشريط لزجة مزدوجة ومكان في زجاجة 100ml، إضافة حوالي 50ml heptane، ختم زجاجة، والصخور لعدة أيام. عند استخدام، إضافة heptane إذا كان الغراء سميكة جدا.

غرفة الجفاف:
تأخذ طبق بيتري 100 ملم، ووضع جزء واحد من طبق 35 ملم داخل لجعل "الجدول" وإضافة Drierite (كبريتات الكالسيوم اللامائية) حوله بحيث ارتفاع دريريت ليست أعلى من "الجدول" وتغطية. سيتم وضع غطاء مع الأجنة على هذه "الطاولة" للجفاف قبل الحقن. انها فكرة جيدة لاستخدام ما لا يقل عن بعض يدل Drierite وتغييره عندما تغير لونه.

بروتوكول:
يمكن استخدام هذا البروتوكول لحقن أي كاشف قابل للذوبان تقريبا في الجنين التزامني Drosophila: على سبيل المثال، إما بروتين فلوري للمراقبة أو مثبط بروتين مستهدف أو كليهما.

1. جمع الأجنة

1. وضع طبق عصير العنب جديدة على القفص وضع.
2. إزالة هذه اللوحة بعد ساعة واحدة، وهذا هو أول مجموعة من اليوم وغالبا ما تكون ليست جيدة جدا. يمكن التخلص منه.
3. تغيير لوحة كل ساعة للحفاظ على جمع الأجنة لمدة ساعة واحدة لكل منهما.

2. إعداد غطاء الغطاء

1. وضع 50 × 22mm coverslip على جانب واحد من شريحة المجهر. الشريط الزوايا الأربع إلى الشريحة حتى لا تتحرك.
2. باستخدام قضيب القطن يميل، ووضع طبقة واحدة من الغراء heptane في سطر واحد على coverslip (الغراء لا ينبغي أن تكون لزجة وينبغي أن تجف في بضع ثوان، وإلا إضافة المزيد من heptane).
3. وضع قطعة من الشريط لزجة مزدوجة على الشريحة نحو جانب غطاء.

3. إعداد الأجنة

ملاحظة: يجب تصوير الأجنة بعد حوالي ساعتين من بدء التجميع ، لذا ابدأ الخطوات التالية مما يتيح وقتا كافيا للانتهاء منها ضمن هذا الإطار الزمني.

1. مع فرشاة مبللة بعناية التقاط الأجنة من لوحة عصير العنب ووضعها على شريط لاصق مزدوج على الشريحة.
2. باستخدام الجزء الخارجي من ملاقط، لفة الأجنة على الشريط لزجة مزدوجة حتى chorion (الغشاء الخارجي) فواصل مفتوحة.
3. التقاط الجنين عن طريق المتداول بلطف على المشيمة بحيث العصي على ملاقط ووضعه على الغراء heptane على coverslip مع الجانب الطويل من الجنين موازية للجانب الطويل من coverslip. إعداد 10 إلى 20 جنينا في صف واحد.
4. قم بإزالة الغطاء وضعه في غرفة الجفاف لمدة 3 إلى 8 دقائق (يعتمد ذلك على رطوبة الغرفة والكمية التي سيتم حقنها).
5. مكان على غرفة معدنية مع الشحوم فراغ.
6. قم بتغطية الأجنة بزيت الهالوكربون 700 لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة جاهزة الآن للحقن.

4. حقن الأجنة

1. العثور على الأجنة تحت هدف 16x.
2. نقل الأجنة بعيدا، والعثور على الإبرة دون تحريك الطائرة المحورية.
3. مركز الإبرة وتحريكه دون تحريكه في اتجاه س أو ص.
4. إذا لم تكن الإبرة مفتوحة، ضع حافة الغطاء في مجال الرؤية، ولكن ليس حيث ستكون الإبرة، وخفض الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. بعناية فائقة تحريك غطاء حتى يضرب الإبرة ويكسر بلطف فتحه. إذا كانت الإبرة مفتوحة، انتقل إلى الخطوة 5. (الإبر يمكن فتحها مع حمض الهيدروفلوريك قبل ملء).
5. وضع الأجنة في الرأي (ولكن ليس حيث الإبرة سوف تكون)، وانخفاض الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرات السائل لطيفة من الإبرة.
6. بعناية ولكن بثبات تحريك الجنين في الإبرة وحقن قطرة في الجنين ونقل الجنين بعيدا. (أو اتبع تعليمات جهاز الحقن الخاص بك).
7. بعد حقن جميع الأجنة ، فهي جاهزة للمراقبة على المجهر confocal.