Microinjeção de Embriões DeSerção Viva Drosophila: Entrega antecipada de reagentes ao embrião em desenvolvimento

Overview

Este vídeo descreve como realizar microinjeções que entregam reagentes em embriões Drosophila vivos. Os pesquisadores podem usar esse método para introduzir compostos exógenos, como ácidos nucleicos e proteínas durante os estágios iniciais do desenvolvimento de embriões. O protocolo em destaque demonstra como configurar e realizar o procedimento de injeção de qualquer reagente solúvel – aqui, uma proteína fluorescente para experimentos de imagem ao vivo.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Brust-Mascher e Scholey, Técnicas de Microinjeção para Estudar Mitose no Embrião Sincicial Drosophila melanogaster , J. Vis. Exp. (2009).

Receitas:

Pratos de suco de uva:

• 5,5g bacto agar

• 14,5 g dextrose ou glicose

• 7,15 g de sacarose

• Concentrado de suco de uva de 45 ml (100% suco).

• 204,5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

Misture todos os ingredientes e micro-ondas até ferver.
Adicione 2,8 ml de mistura de ácido (mistura de ácido: 20,9 ml de ácido propônico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml H₂0)

Misture e despeje em pratos de Petri de 35 mm. Deixe solidificar à temperatura ambiente por um ou dois dias. Se as placas não forem usadas em breve, lacre com parafilme e mantenha a 4 °C (deixe equilibrar-se ao RT antes de usar).

Pasta de levedura:
Dissolva cerca de uma colher de chá de levedura (Sigma YSC2, levedura de Saccharomyces cerevisiae tipo II) em água para formar uma pasta grossa. Coloque uma pequena quantidade disso em cada prato de suco de uva pouco antes de usar.

Tampão de injeção:

• 150 mM K-Aspartate

• 10 mM K-fosfato

• 20 mM imidazol, pH 7.2

Cola heptana:
Desencotar fita adesiva dupla e colocar em uma garrafa de 100ml, adicionar cerca de 50ml de heptano, selar a garrafa e balançar por vários dias. Ao usar, adicione heptano se a cola estiver muito grossa.

Câmara de desidratação:
Pegue uma placa de Petri de 100 mm, coloque uma parte de uma placa de 35 mm dentro para fazer uma "mesa" e adicione Drierite (sulfato de cálcio anidro) ao seu redor para que a altura do Drierite não seja maior que a "mesa" e a tampa. O deslizamento com embriões será colocado nesta "mesa" para desidratação antes da injeção. É uma boa ideia usar pelo menos alguns indicando Drierite e alterá-lo quando ele mudou de cor.

protocolo:
Este protocolo pode ser usado para injeção de praticamente qualquer reagente solúvel no embrião sincicial Drosophila: Por exemplo, seja uma proteína fluorescente para observação ou um inibidor de proteína alvo ou ambos.

1. Coleção de embriões

1. Coloque um novo prato de suco de uva na gaiola de leito.
2. Remova esta placa após uma hora, esta é a primeira coleção do dia e muitas vezes não é muito boa. Pode ser descartado.
3. Troque a placa a cada hora para continuar coletando embriões por uma hora cada.

2. Preparação do Deslizamento de Cobertura

1. Coloque uma tampa de 50 x 22mm em um lado de um slide de microscópio. Grave os quatro cantos do slide para que ele não se mova.
2. Usando um aplicador de ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha no deslizamento de cobertura (a cola não deve ser viscosa e deve secar em poucos segundos, caso contrário adicione mais heptano).
3. Coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide em direção ao lado da mancha de cobertura.

3. Preparação do embrião

NOTA: Os embriões devem ser imagens cerca de 2 horas após o início da coleta, por isso comece as seguintes etapas permitindo tempo suficiente para terminá-los dentro deste período de tempo.

1. Com um pincel umedecido pegue cuidadosamente os embriões da placa de suco de uva e coloque em fita adesiva dupla no slide.
2. Usando a parte externa das pinças, role os embriões sobre a fita pegajosa dupla até que o acorde (a membrana externa) se abra.
3. Pegue o embrião enrolando-o suavemente sobre o acorde para que ele grude na pinça e coloque-o na cola heptane na tampa com o lado longo do embrião paralelo ao lado longo da tampa. Coloque de 10 a 20 embriões em uma fileira.
4. Retire a tampa e coloque-a na câmara de desidratação por 3 a 8 minutos (isso depende da umidade do quarto e da quantidade a ser injetada).
5. Coloque em uma câmara de metal com graxa de vácuo.
6. Cubra os embriões com óleo de halocarboneto 700 para evitar maiores desidratações. Embriões estão prontos para injeção.

4. Injeção de embrião

1. Encontre os embriões com um objetivo de 16x.
2. Afaste os embriões e encontre a agulha sem mover o plano focal.
3. Centralizar a agulha e movê-la para cima sem movê-la na direção x ou y.
4. Se a agulha não estiver aberta, coloque a borda da tampa no campo de visão, mas não onde a agulha estará, e baixe a agulha para o mesmo plano focal. Mova cuidadosamente a mancha até atingir a agulha e quebre-a suavemente. Se a agulha estiver aberta, vá para o passo 5. (As agulhas podem ser abertas com ácido fluorídrico antes do enchimento).
5. Coloque os embriões à vista (mas não onde a agulha estará), abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter boas gotas líquidas da agulha.
6. Mova cuidadosamente, mas constantemente, o embrião para dentro da agulha e injete uma gota no embrião e afaste o embrião. (Ou siga as instruções do seu aparelho de injeção).
7. Depois de todos os embriões terem sido injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal.