Preparazione del cuore di Drosophila: una tecnica per studiare la fisiologia cardiaca nella mosca adulta

Overview

Questo video descrive il cuore adulto della mosca, o altrimenti chiamato vaso dorsale Drosophila. Il protocollo in primo piano dimostra una procedura di dissezione per i preparati cardiaci vivi.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Vogler e Ocorr, Che visualizza il cuore pulsante in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Prima di iniziare

1. Preparare al momento una soluzione di emolinfa artificiale (AH) contenente 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca^2+,8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM saccarosio, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, tutti i reagenti di Sigma Chemicals). Il saccarosio e il trealosio devono essere aggiunti all'AH da soluzioni di stoccaggio refrigerate poco prima dell'uso al fine di prevenire la contaminazione batterica.
2. Portare AH a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione gorgogliando d'aria per almeno 15 minuti.
3. Tirare diversi capillari fini (ad esempio capillari di vetro, 100ul, VWR) necessari per la rimozione del grasso.

2. Cuore di Drosophila semi-intatto dalla mosca adulta

1. Le mosche Drosophila adulte vengono anestetizzate con Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) per 2-5 minuti. Bisogna fare attenzione a non lasciare le mosche nel Fly Nap per esposizioni più lunghe. L'esposizione a breve termine al freddo può anche essere utilizzata per anestetizzare le mosche, ma la CO₂ non è raccomandata in quanto ha effetti più duraturi sulla frequenza cardiaca e sulla ritmicità.
2. Le mosche anestetizzate sono posizionate, lato dorsale verso il basso, in una piastra di Petri rivestita con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobica nelle ali e nel corpo si "attacca" reversibilmente alla gelatina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Questo diventa particolarmente importante durante le successive manipolazioni.
3. Un taglio iniziale viene effettuato utilizzando un paio curvo di forbici a molla (Roboz #5611). Le lame a forbice sono poste sotto le gambe e angolate verso la superficie dorsale del torace vicino al collo. La testa, il cordone nervoso ventrale e le gambe vengono rimossi con un solo taglio. La preparazione viene quindi immersa in una soluzione emolifa artificiale ossigenata (AH).
4. Usando le forbici a molla, la punta posteriore dell'addome (composta da segmenti addominali 7 e 8) viene rimossa con un solo taglio. Ciò fornisce l'accesso per effettuare tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a tagliare la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Il lembo liberato della cuticola addominale ventrale viene quindi rimosso.
5. Nei passaggi 3 e 4 le connessioni anteriori e posteriori dell'intestino vengono recisi, quindi gli organi addominali sono ora tenuti in posizione solo da tracheoli. L'intestino e altri organi addominali possono di solito essere rimossi come una singola massa usando le forcep del gioielliere (Roboz, #55) e il gentil tiro. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco pulsante ancora attaccato alla cuticola dorsale circondata da corpi grassi.
6. I corpi grassi sono piuttosto opachi nel microscopio leggero di conseguenza è spesso necessario rimuovere parte di questo grasso per vedere chiaramente il tubo cardiaco. Ciò si ottiene con una tecnica di liposuzione che utilizza capillari di vetro finemente disegnati. I capillari vengono realizzati utilizzando un estrattore di pipetta standard (ad esempio Sutter P-97 Pipette Puller) e vengono quindi inseriti in tubi di plastica (Tygon, 1/16") attaccati a una fonte di vuoto. Questo sistema viene utilizzato per aspirare il grasso in eccesso da tutto il tubo cardiaco. La forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta, quindi non devono essere utilizzate pipette con punte di diametro superiore a 40 micron. Occorre fare estrema attenzione ad evitare di toccare il cuore stesso e poiché la porzione posteriore del cuore è molto fragile che la regione dovrebbe essere evitata del tutto.
7. Il tubo cardiaco adulto Drosophila è ora esposto e dovrebbe battere. Se necessario, la cuticola e il cuore attaccato possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla vaselina e domarla con cura verso il basso, evitando nuovamente qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto la soluzione che bagna la preparazione deve essere sostituita con AHL fresco. Questa preparazione deve essere autorizzata ad equilibrare per 20-30 minuti con ossigenazione prima di eventuali manipolazioni. Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti, deve essere perfusa con AHL fresco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical