Förberedelse av Drosophila Heart: En teknik för att studera hjärtfysiologi i vuxenflugan

Overview

Den här videon beskriver flugans vuxna hjärta, eller på annat sätt kallat Drosophila dorsalfartyg. Det presenterade protokollet visar en dissekeringsprocedur för levande hjärtpreparat.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Vogler och Ocorr, Visualizing the Beating Heart i Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Innan du börjar

1. Nybered konstgjord hemolymflösning (AH) som innehåller 108mM Na⁺, 5mM K +, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl_2,1mM NaH₂PO_4,4mM NaHCO_3,10mM sackaros, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, alla reagenser från Sigma Chemicals). Sackaros och trehalos bör tillsättas ah från kyllagerlösningar strax före användning för att förhindra bakteriell förorening.
2. För AH till rumstemperatur och syresätta lösningen genom att luftbubbla i minst 15 minuter.
3. Dra flera fina kapillärer (t.ex. glas kapillärer, 100ul, VWR) som krävs för avlägsnande av fett.

2. Halv intakt Drosophila Heart från vuxenflugan

1. Vuxna Drosophila flugor är sövd med Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) i 2-5 minuter. Var försiktig så att flugorna inte lämnas i Fly Nap för längre exponeringar. Kortvarig exponering för kyla kan också användas för att bedöva flugor men CO₂ rekommenderas inte eftersom det har långvariga effekter på hjärtfrekvens och rytmicitet.
2. Sövda flugor placeras, dorsal sida ner, i en Petri skål belagd med ett tunt lager petroleumgel. Den hydrofobiska nagelbanden i vingarna och kroppen "fastnar" reversibelt på geléen men flugan kan flyttas vid behov. Detta blir särskilt viktigt under efterföljande manipuleringar.
3. Ett första snitt görs med en böjd fjädersax (Roboz #5611). Saxbladen placeras under benen och vinklas ner mot bröstkorgens ryggyta nära halsen. Huvudet, ventral nervkabel och ben avlägsnas med ett enda snitt. Preparatet dränks sedan i en syresatt, konstgjord hemolymflösning (AH).
4. Med hjälp av vårsaxen avlägsnas bukens bakre spets (bestående av buksegmenten 7 och 8) med ett enda snitt. Detta ger tillgång till att göra laterala snitt längs båda kanterna av buken och tjänar till att bryta anslutningen mellan den bakre tarmen och buken nagelband. Den frigjorda klaffen av ventral buken nagelband tas sedan bort.
5. I steg 3 och 4 skärs tarmens främre och bakre anslutningar så att bukorganen nu endast hålls på plats av luftstrupar. Tarmen och andra bukorgan kan vanligtvis avlägsnas som en enda massa med hjälp av juvelerarens tång (Roboz, #55) och mild tugging. Att ta bort de inre organen avslöjar det bultande hjärtröret som fortfarande är fäst vid dorsal nagelband omgiven av feta kroppar.
6. Fettkropparna är ganska ogenomskinliga i ljusmikroskopet följaktligen är det ofta nödvändigt att ta bort en del av detta fett för att se hjärtröret tydligt. Detta åstadkoms genom en fettsugningsteknik med fint ritade glas kapillärer. Kapillärer tillverkas med en vanlig pipettdragare (t.ex. Sutter P-97 Pipette Puller) och sätts sedan in i plaströr (Tygon, 1/16") som är fästa vid en vakuumkälla. Detta system används för att suga av överflödigt fett från runt hjärtröret. Sugkraften är proportionell mot spetsdiametern så att pipetter med spetsar större än 40 mikron i diameter inte ska användas. Extrem försiktighet måste vidtas för att undvika att röra vid själva hjärtat och eftersom den bakre delen av hjärtat är mycket bräcklig bör regionen undvikas helt och hållet.
7. Det vuxna Drosophila hjärtröret är nu exponerat och borde slå. Vid behov kan nagelbandet och det fästa hjärtat flyttas genom att försiktigt lyfta nagelbandet ur petroleumgelen och försiktigt tämja den tillbaka ner, igen undvika kontakt med hjärtvävnaden. Vid denna tidpunkt bör lösningen som badar preparatet ersättas med färsk AHL. Detta preparat bör tillåtas jämvikta i 20-30 minuter med syresättning före eventuella manipuleringar. Om preparatet ska bibehållas längre än 60 minuter ska det genomsyras av färsk AHL.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical