Forberedelse af Drosophila Heart: En teknik til at studere hjertefysiologi i voksenfluen

Overview

Denne video beskriver fluens voksne hjerte, eller på anden måde kaldet Drosophila dorsale fartøj. Den fremhævede protokol demonstrerer en dissektion procedure for levende hjerte forberedelser.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Vogler og Ocorr, Visualizing the Beating Heart i Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Før du starter

1. Friskforberedt kunstig hæmolymph (AH) opløsning indeholdende 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca^2+,8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM saccharose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, alle reagenser fra Sigma Chemicals). Saccharose og trehalose bør tilsættes AH fra kølelagre lige før brug for at forhindre bakteriel forurening.
2. Bring AH til stuetemperatur og ilt opløsningen ved luft-boblende i mindst 15 min.
3. Træk flere fine kapillærer (f.eks. glaskapillærer, 100ul, VWR), der kræves til fjernelse af fedt.

2. Semi-intakt Drosophila Heart fra Adult Fly

1. Voksne Drosophila fluer bedøves med Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) i 2-5 minutter. Der skal udvises forsigtighed for ikke at efterlade fluerne i Flyveluluen til længere eksponeringer. Kortvarig udsættelse for kulde kan også bruges til at bedøve fluer, men CO₂ anbefales ikke, da det har længerevarende virkninger på puls og rytmiskhed.
2. Bedøvede fluer er placeret, dorsal side ned, i en petriskål belagt med et tyndt lag vaseline. Den hydrofobe kutikula i vingerne og kroppen reversibly "stick" til gelé, men fluen kan flyttes, hvis det er nødvendigt. Dette bliver især vigtigt under efterfølgende manipulationer.
3. Et første snit er lavet ved hjælp af en buet par fjeder saks (Roboz #5611). Saksebladene placeres under benene og vinkles ned mod brystkassens rygoverflade nær nakken. Hovedet, ventral nerveledningen og benene fjernes med et enkelt snit. Præparatet nedsænkes derefter i en iltet, kunstig hæmolymph (AH) opløsning.
4. Ved hjælp af fjedersaks fjernes den bageste spids af maven (bestående af abdominalsegmenter 7 og 8) med et enkelt snit. Dette giver adgang til at gøre laterale nedskæringer langs begge kanter af maven og tjener til at bryde forbindelsen mellem den bageste tarm og abdominal kutikula. Den frigivne flap af ventral abdominal kutikula fjernes derefter.
5. I trin 3 og 4 er tarmens forreste og bageste forbindelser afskåret, så abdominalorganerne nu kun holdes på plads af trakeoler. Tarmen og andre abdominal organer kan normalt fjernes som en enkelt masse ved hjælp af guldsmed's pincet (Roboz, #55) og blid slæbebåd. Fjernelse af de indre organer afslører bankende hjerte rør stadig er knyttet til dorsal kutikula omgivet af fedt organer.
6. Fedtlegemerne er ret uigennemsigtige i lysmikroskopet, derfor er det ofte nødvendigt at fjerne noget af dette fedt for at se hjerterøret tydeligt. Dette opnås ved en fedtsugning teknik ved hjælp af fint tegnet glas kapillærer. Kapillærer fremstilles ved hjælp af en standard pipettetrækker (f.eks. Sutter P-97 Pipette Puller) og indsættes derefter i plastrør (Tygon, 1/16") fastgjort til en vakuumkilde. Dette system bruges til at suge overskydende fedt fra omkring hjerterøret. Sugekraften er proportional med spidsdiameteren, så der bør ikke anvendes pipetter med spidser, der er større end 40 mikron i diameter. Der skal udvises stor omhu for at undgå at røre hjertet selv, og fordi den bageste del af hjertet er meget skrøbelig, at regionen bør undgås helt.
7. Den voksne Drosophila hjerte rør er nu udsat og bør slå. Hvis det er nødvendigt, kutikula og fastgjort hjerte kan flyttes ved forsigtigt at løfte neglebånd ud af vaseline og omhyggeligt tæmme den ned igen, igen undgå enhver kontakt med hjertevævet. På dette tidspunkt skal opløsningen badning præparatet erstattes med frisk AHL. Dette præparat bør have lov til at ekvilibrere i 20-30 minutter med iltning forud for eventuelle manipulationer. Hvis præparatet skal opbevares i mere end 60 minutter, skal det perfunderes med frisk AHL.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical