Preparación de Drosophila Heart: Una técnica para estudiar fisiología cardíaca en la mosca adulta

Overview

Este video describe el corazón adulto de la mosca, o de otra manera llamado el vaso dorsal de Drosophila. El protocolo destacado demuestra un procedimiento de disección para preparaciones cardíacas en vivo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Vogler y Ocorr, Visualizando el Corazón Palpitante en Drosophila, J. Vis. (2009).

1. Antes de empezar

1. Solución de hemolífago artificial (AH) recién preparado que contenga 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl_2,1mM NaH₂PO_4,4mM NaHCO_3,10mM sacarosa, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, todos reactivos de Sigma Chemicals). La sacarosa y la trehalosa deben añadirse a la AH a partir de soluciones de stock refrigerado justo antes de su uso con el fin de prevenir la contaminación bacteriana.
2. Lleve AH a temperatura ambiente y oxigene la solución burbujeando por aire durante al menos 15 minutos.
3. Tire de varios capilares finos (por ejemplo, capilares de vidrio, 100ul, VWR) necesarios para la eliminación de grasa.

2. Corazón semi-intacto de Drosophila de la mosca adulta

1. Las moscas Drosophila adultas son anestesiadas con Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) durante 2-5 minutos. Se debe tener cuidado de no dejar las moscas en la siesta mosca para exposiciones más largas. La exposición a corto plazo al frío también se puede utilizar para anestesiar moscas, pero no se recomienda el CO_2, ya que tiene efectos más duraderos sobre la frecuencia cardíaca y la rítmica.
2. Las moscas anestesiadas se colocan, lado dorsal hacia abajo, en una placa de Petri recubierta con una fina capa de vaselina. La cutícula hidrofóbica en las alas y el cuerpo se "adhieren" reversiblemente a la jalea, pero la mosca se puede reposicionar si es necesario. Esto se vuelve especialmente importante durante las manipulaciones posteriores.
3. Un corte inicial se hace usando un par curvo de tijeras de resorte (Roboz #5611). Las cuchillas de tijera se colocan debajo de las piernas y se inclinan hacia abajo hacia la superficie dorsal del tórax cerca del cuello. La cabeza, el cordón nervioso ventral y las piernas se retiran con un solo corte. A continuación, la preparación se sumerge en una solución de hemolífago artificial (AH) oxigenada.
4. Usando tijeras de resorte, la punta posterior del abdomen (compuesta por segmentos abdominales 7 y 8) se elimina con un solo corte. Esto proporciona acceso para hacer cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. A continuación, se retira la solapa liberada de cutícula abdominal ventral.
5. En los pasos 3 y 4 las conexiones anteriores y posteriores del intestino se cortan por lo que los órganos abdominales ahora se mantienen en su lugar sólo por los tráqueols. El intestino y otros órganos abdominales generalmente se pueden extraer como una sola masa usando fórceps de joyero (Roboz, #55) y tugging suave. La extracción de los órganos internos revela el tubo cardíaco palpitante todavía unido a la cutícula dorsal rodeada de cuerpos gordos.
6. Los cuerpos de grasa son bastante opacos en el microscopio de luz por lo tanto, a menudo es necesario eliminar parte de esta grasa con el fin de ver el tubo del corazón con claridad. Esto se logra mediante una técnica de liposucción utilizando capilares de vidrio finamente dibujados. Los capilares se fabrican utilizando un tirador de pipeta estándar (por ejemplo, Sutter P-97 Pipette Puller) y luego se insertan en tubos de plástico (Tygon, 1/16") unidos a una fuente de vacío. Este sistema se utiliza para succionar el exceso de grasa de alrededor del tubo cardíaco. La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que no se deben utilizar pipetas con puntas de más de 40 micras de diámetro. Se debe tener mucho cuidado para evitar tocar el corazón mismo y porque la parte posterior del corazón es muy frágil esa región debe evitarse por completo.
7. El tubo cardíaco drosophila adulto ahora está expuesto y debe estar latiendo. Si es necesario, la cutícula y el corazón unido se pueden reposicionar levantando suavemente la cutícula de la vaselina y domándola cuidadosamente hacia abajo, evitando de nuevo cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este punto, la solución de baño de la preparación debe sustituirse por AHL fresco. Esta preparación debe poder equilibrarse durante 20-30 minutos con oxigenación antes de cualquier manipulación. Si la preparación debe mantenerse durante más de 60 minutos, debe perfundirse con AHL fresco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical