Préparation du cœur de Drosophila : une technique pour étudier la physiologie cardiaque dans la mouche adulte

Overview

Cette vidéo décrit le cœur adulte de la mouche, ou autrement appelé le vaisseau dorsale Drosophila. Le protocole présenté démontre une procédure de dissection pour les préparations cardiaques vivantes.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Vogler et Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Avant de commencer

1. Fraîchement préparer la solution d’hémolympe artificiel (AH) contenant 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM saccharose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, tous les réacoleurs de Sigma Chemicals). Le saccharose et la tréhalose devraient être ajoutés à l’AH à partir de solutions de bouillon réfrigéré juste avant l’utilisation afin d’éviter la contamination bactérienne.
2. Apportez AH à température ambiante et oxygénez la solution en faisant bouillonner l’air pendant au moins 15 minutes.
3. Tirez plusieurs capillaires fins (p. ex. Capillaires en verre, 100ul, VWR) nécessaires à l’élimination des graisses.

2. Coeur semi-intact de Drosophila de la mouche adulte

1. Les mouches adultes de Drosophila sont anesthésiées avec Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) pendant 2-5 minutes. Il faut veiller à ne pas laisser les mouches dans la sieste volante pour des expositions plus longues. L’exposition à court terme au froid peut également être utilisée pour anesthésier les mouches, mais le CO_{2 n’est} pas recommandé car il a des effets plus durables sur la fréquence cardiaque et la rythmique.
2. Les mouches anesthésiées sont placées, côté dorsale vers le bas, dans une boîte de Pétri recouverte d’une fine couche de gelée de pétrole. La cuticule hydrophobe dans les ailes et le corps réversiblement « coller » à la gelée, mais la mouche peut être repositionnée si nécessaire. Cela devient particulièrement important lors des manipulations ultérieures.
3. Une première coupe est faite à l’aide d’une paire incurvée de ciseaux à ressort (Roboz #5611). Les lames de ciseaux sont placées sous les jambes et inclinées vers la surface dorsale du thorax près du cou. La tête, le cordon nerveux ventral et les jambes sont enlevés d’une seule coupe. La préparation est ensuite immergée dans une solution oxygénée et artificielle d’hémolympe (AH).
4. À l’aide de ciseaux à ressort, la pointe postérieure de l’abdomen (composée des segments abdominaux 7 et 8) est enlevée d’une seule coupe. Cela permet d’effectuer des coupures latérales le long des deux bords de l’abdomen et sert à rompre la connexion entre l’intestin postérieur et la cuticule abdominale. Le rabat libéré de cuticule abdominale ventrale est alors enlevé.
5. Dans les étapes 3 et 4, les connexions antérieures et postérieures de l’intestin sont sectionnées de sorte que les organes abdominaux ne sont maintenant maintenus en place que par des trachéols. L’intestin et d’autres organes abdominaux peuvent généralement être enlevés comme une seule masse à l’aide de forceps bijoutier (Roboz, #55) et le tir léger. L’ablation des organes internes révèle le tube cardiaque battant encore attaché à la cuticule dorsale entourée de gros corps.
6. Les corps gras sont assez opaques dans le microscope léger par conséquent, il est souvent nécessaire d’enlever une partie de cette graisse afin de voir le tube cardiaque clairement. Ceci est accompli par une technique de liposuccion utilisant des capillaires en verre finement dessinés. Les capillaires sont fabriqués à l’aide d’un tire-pipette standard (p. ex. sutter P-97 Pipette Puller) et sont ensuite insérés dans des tubes en plastique (Tygon, 1/16 ») fixés à une source de vide. Ce système est utilisé pour aspirer l’excès de graisse autour du tube cardiaque. La force d’aspiration est proportionnelle au diamètre de la pointe, de sorte que les pipettes avec des pointes de plus de 40 microns de diamètre ne doivent pas être utilisées. Un soin extrême doit être pris pour éviter de toucher le cœur lui-même et parce que la partie postérieure du cœur est très fragile que la région doit être évitée tout à fait.
7. Le tube cardiaque adulte Drosophila est maintenant exposé et devrait battre. Si nécessaire, la cuticule et le cœur attaché peuvent être repositionnés en soulevant doucement la cuticule de la gelée de pétrole et en l’apprivoisant soigneusement vers le bas, évitant encore une fois tout contact avec le tissu cardiaque. À ce stade, la solution de bain de la préparation doit être remplacé par AHL frais. Cette préparation doit être autorisée à équilibrer pendant 20-30 minutes avec oxygénation avant toute manipulation. Si la préparation doit être maintenue pendant plus de 60 minutes, elle doit être perfusée d’AHL frais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical