FITC-Dextran-utfodring: En metod för att kvantifiera tarmpermeabilitet i C. elegans

Overview

Denna video introducerar en metod för att visualisera och mäta integriteten hos C. elegans tarm lumen genom att mata maskar FITC-märkta dextran.  Exempelprotokollet visar analysen med 3,3'-diindolylmethane (DIM)-behandlade och patogenmatade maskar.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Le et al, Mäta effekterna av bakterier och kemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Beredning av NGM-plattor för testning av effekterna av en kemikalie (DIM) på C. elegans Feds tarmpermeabilitet med P. aeruginosa
   1. Tillsätt 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destillerat vatten, en magnetomrörare och 6,8 g agar till en 500 ml glasflaska (NGM-agar).
   2. Tillsätt 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destillerat vatten och en magnetisk omrörare utan agar till ytterligare 500 ml glasflaska (NGM-buljong).
   3. Autoklavera de två flaskorna (från steg 1.1–1.2), en tom 100 ml glasflaska och en tom 500 ml glasflaska i 15 min vid 121 °C. Låt sedan mediet som innehåller flaskor svalna till 55 °C i vattenbadet i 30 minuter. Håll agarmediet i vattenbadet och ta bort flaskan som innehåller buljong (från steg 1.2) för nästa steg.
   4. Tillsätt tillsatskemikalierna till NGM-buljongen: 0,4 ml 1 M CaCl_2,0,4 ml kolesterol i etanol (ml), 0,4 ml 1 M MgSO₄ och 10 ml 1 M KPO₄ (alla dessa komponenter måste steriliseras bortsett från kolesterolet i etanol). Rör sedan om blandningen noggrant med en magnetisk omrörare vid 55 °C.
   5. Märk den autoklaverade tomma glasflaskan på 500 ml med dimetylsulfoxid (DMSO) och den autoklaverade tomma 100 ml glasflaskan med DIM.
   6. Överför 50 ml NGM-buljong till den DIM-märkta 100 ml-flaskan. Tillsätt 500 μL 20 mM DIM lager i flaskan och blanda väl.
      OBS: DIM löses upp i DMSO (20 mM DIM-lager).
   7. Ta snabbt bort NGM-agarmediet från vattenbadet, tillsätt 50 ml av NGM-agarmediet i den DIM-märkta flaskan och blanda noggrant.
   8. Placera en 20 ml alikvot AV DIM-innehållande NGM-medium i varje 90 mm x 15 mm Petri-skål. Cirka fem DIM-innehållande NGM-plattor kan tillverkas av detta steg.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av DIM i varje NGM-platta kommer att vara 100 μM.
   9. För att förbereda dmso-innehållande NGM-platta, överför 150 ml NGM-buljong till den DMSO-märkta 500 ml-flaskan. Tillsätt 1,5 ml DMSO till flaskan och blanda väl.
   10. Tillsätt 150 ml av NGM-agarmediet till den DMSO-märkta flaskan och blanda noggrant.
   11. Placera en 20 ml alikvot DMSO-innehållande NGM-medium i varje 90 mm x 15 mm Petri-skål. Cirka femton DMSO-innehållande NGM-plattor kan tillverkas av detta steg.
       OBS: Den slutliga koncentrationen av DMSO i varje NGM-platta kommer att vara 0,5%.
   12. Stelna plattorna i rumstemperatur i minst 3 timmar och förvara dem vid 4 °C tills de används.
       OBS: Protokollet kan pausas här.
   13. Ta bort E. coli OP50- eller P. aeruginosa PAO1-kulturen från kylskåpet på 4 °C och virvel kulturen ordentligt innan den sprids på NGM-plattorna.
   14. Lägg 800 μL av E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakteriekultur på varje färsk NGM-agarplatta och låt plattorna torka i en 20 °C inkubator över natten.
       OBS: Protokollet kan pausas här. För det tredje försöket (figur 1) förbereddes två DMSO-innehållande NGM-plattor belagda med levande E. coli OP50, en DMSO-innehållande NGM-platta belagd med levande P. aeruginosa PAO1 och en DIM-innehållande NGM-platta belagd med levande P. aeruginosa PAO1.
2. Behandling av bakterier eller DIM- och FITC-dextranmatning
   1. Inkubera de ålderssynkronerade äggen vid 20 °C i 64 timmar på NGM-tallrikar kompletterade med levande E. coli OP50 som mat.
   2. Tvätta den ålderssynkronerade L4 larven med S-buffert och överför dem (mer än cirka 500 maskar) till behandlingsplattorna NGM som innehåller olika bakterier och kemikalier. Inkubera dem vid 20 °C i 48 timmar.
      OBS: Behandlingstiden kan variera från 24 till 72 timmar, enligt de bakterier och kemikalier som används. Den terapeutiska eller förebyggande effekten av DIM kan också utvärderas genom att förbehandla maskarna med patogener och sedan behandla maskarna med DIM (den terapeutiska effekten) eller genom att förbehandla maskarna med DIM och sedan behandla med patogener (den förebyggande effekten).
   3. För att förbereda fitc-dextran-kompletterade plattor, blanda 2 ml värmeinaktiverade E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Dela sedan 100 μL av FITC-dextran- och E. coli OP50-blandningen i tjugo färska NGM-agarplattor (60 mm x 15 mm) och låt plattorna torka i 1 h på en ren bänk.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av FITC-dextran i varje NGM-platta kommer att vara 20 μg/ml.
   4. Förbered fem E. coli OP50-innehållande NGM-plattor utan FITC-dextran för fordonskontrollbehandlingen. För detta ändamål, dela 100 μL värmeinaktiverade E. coli OP50 till varje färska NGM-agarplattor (60 mm x 15 mm) och låt plattorna torka i 1 timme på en ren bänk.
      OBS: För varje oberoende experiment krävs femton FITC-dextran-kompletterade NGM-plattor och fem NGM-plattor utan FITC-dextran.
   5. Efter 48 h behandling (från steg 2.2), tvätta maskarna med S-buffert, överför maskarna till FITC-dextran-kompletterade plattor och NGM-plattorna utan FITC-dextran och inkubera plattorna över natten (14-15 h).
      OBS: För varje behandlingsgrupp krävs 5 replikat av FITC-dextranfärgning (eller fordonsstyrningsmatning).
   6. Tvätta maskarna med S-buffert och låt dem krypa i den färska NGM-agarplattan i 1 h.
      OBS: För varje oberoende experiment behövs totalt 20 färska NGM-plattor. I det här steget kan du använda NGM-plattan kompletterad utan eller med E. coli OP50.
   7. Tillsätt 50 μL 4% formaldehydlösning till varje brunn på en svart 96-brunns platt bottenplatta. Överför cirka 50 maskar från varje NGM-platta till varje brunn för fluorescensmätningar. Efter 1 till 2 min, ta noggrant bort all formaldehyd från varje brunn och tillsätt 100 μL monteringsmedium för att täcka brunnarna.
      OBS: Formaldehydlösning (4%) används för att immobilisera och fixa maskarna. För varje behandlingsgrupp används 5 brunnar (5 replikat) för bildanalys.
3. Imaging C. elegans med Operetta Imaging System och Bestämning av intestinal permeabilitet genom att mäta FITC-dextran Fluorescence Uptake
   OBS: Fluorescerande stereomikroskopi kan användas för bildanalys istället för Operetta-systemet.
   1. Fånga fluorescensbilder och mät fluorescensintensiteten med hjälp av Operetta High-Content Imaging System och analysera bilderna med Harmony-programvara.
   2. I Harmony-programvaran trycker du på ikonen Öppna locket för att öppna locket och sätta plattan i maskinen.
   3. Ställ in parametrarna.
   4. Klicka på Ställ in, välj plåttyp (96-brunns corning flat-bottom) och lägg till kanalerna (ljusfälts- och EGFP-kanaler).
   5. Justera layouten. Gå till layoutmarkeringenoch välj sedan Spåra och justera parametrarna (första bilden vid 1 μm, antalet plan är 10, avståndet är 1 μm).
   6. Välj en av behandlingsbrunnarna och ett fångstfält och tryck på Testa för att kontrollera om bilderna är tillfredsställande i avsnittet Kör experiment.
   7. Om bilderna är tillfredsställande går du tillbaka till avsnittet Konfigurera och trycker på ikonen Återställ i slutet av skärmen. Välj sedan alla målbrunnar och ett lämpligt antal fångstfält.
   8. Gå till Kör experiment igen och ange plåtnamnet och tryck sedan på Start för att börja bearbeta.
   9. Om du vill mäta intensiteten i fluorescensen går du till bildanalysavsnittet och matar in bilden. Hitta cellen genom att välja EGFP-kanal och metod B. Justera det gemensamma tröskelvärdet till 0,5, område till >200 μm², delningsfaktor till 3,0, individuell tröskel till 0,18 och kontrast till mer än 0,18. Beräkna sedan intensitetsegenskaperna och välj medelvärdet som utdata. Spara installationen genom att trycka på ikonen Använd.
   10. Gå till avsnittet Utvärdering för att mäta intensiteten genom att skaffa en värmekarta och datatabell. Ställ in avläsningsparametern på Celler – TRFP-medelvärde för intensitetscell – Medelvärde per brunn och starta utvärderingen.
       OBS: Protokollet kan pausas här.
   11. Om du vill extrahera data från Operetta klickar du på knappen Inställning och väljer Datahantering.
   12. Välj Skriv arkivoch öppna sedan bläddring och markera filen.
   13. Om du vill markera filen klickar du på den lilla + signalen i det vänstra hörnet och klickar sedan på Mått och väljer Plåtnamn.
   14. Markera filen och klicka på OK.
   15. Välj sökvägen för att spara filen genom att klicka på bläddringssignalen på den aktiva sökvägen.
   16. Klicka på Start om du vill spara datafilen.
       OBS: Protokollet kan pausas här.
4. Statistisk analys av FITC-dextran Fluorescence av C. elegans
   1. Importera data och beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (SD) med hjälp av en statistikprogramvara.
   2. Analysera den signifikanta skillnaden med enkelvägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys multipla jämförelsetest.

Representative Results

Figur 1: Effekten av DIM på tarmpermeabiliteten hos C. elegans fed P. aeruginosa. Mikroskopibilder av maskar från(A) E. coli OP50 utan FITC-dextranmatning,(B) E. coli med FITC-dextranmatning,(C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextranmatning och ( D )P. aeruginosa och DIM (100 μM) sambehandling med FITC-dextranmatning. Skalstång = 1 mm (vit) och 200 μm (svart). Ålderssynkroniserade L4 larver inkuberades i 48 h i NGM-plattor sådda med levande E. coli (A, B), levande P. aeruginosa (C), levande P. aeruginosa och DIM (D). Sedan överfördes maskarna till skyltar som innehöll FITC-dextran (B-D), med undantag för fordonskontrollen (A). (E) FITC fluorescensintensiteten indikerar att C. eleganss magpermeabilitet påverkades av DIM. Kolumner och felstaplar indikerar medelvärdet ± SD. ***P < 0.001 för betydande skillnad från fordonets kontroll. ^###P < 0.001 och ^##P < 0.01 för betydande skillnad från FITC-dextran-behandlade maskar som matas med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Detta diagram är representativt för två oberoende experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N