Zebrafish Rheotaxis Assay: Une méthode pour mesurer le comportement d’orientation en réponse aux différents taux d’écoulement de l’eau

Overview

Cette vidéo décrit l’analyse des rhétaxis chez le poisson zèbre. La méthode consiste à mesurer le comportement d’orientation du poisson zèbre en réponse à différents débits d’eau sous l’influence de différents champs magnétiques.

Protocol

1.Set up du champ magnétique avec la manipulation unidimensionnelle de champ magnétique

1. Allumez l’unité de puissance( figure 1A).
2. Placez le tunnel en bobine à l’endroit où le protocole rhéotactic sera effectué (section 3) mais gardez-le déconnecté de l’appareil de natation (Figure 1A). Placez une sonde magnétique reliée à un Gauss/Teslameter à l’intérieur du tunnel et vérifiez quelle tension est nécessaire pour obtenir la valeur de champ magnétique choisie le long de l’axe principal du tunnel.
   REMARQUE: En raison des propriétés magnétiques d’un solénoïde, le champ est raisonnablement uniforme à l’intérieur du tunnel; cela peut être vérifié en déplaçant lentement la sonde à la fois horizontalement et verticalement.
3. Déconnectez la sonde et connectez le tunnel d’écoulement à l’appareil de natation.
4. Commencez par le protocole rhéotactic (section 3).

2. Mise en place du champ magnétique avec la manipulation tridimensionnelle du champ magnétique

1. Allumez les pilotes CPU, DAC et bobine (Figure 1B).
2. Réglez le champ magnétique choisi sur chacun des trois axes (x, y et z).
3. Placez le tunnel au centre de l’ensemble de paires Helmholtz.
4. Commencez par le protocole rhéotactic (section 3).

3. Essai des Rhétaxis de poisson zèbre dans la chambre de flux

1. Transférer un à cinq poissons dans le tunnel d’écoulement à l’aide d’un réservoir de 2 L avec les côtés et le fond obscurci.
2. Allumez la pompe et réglez la vitesse d’écoulement dans le tunnel à 1,7 cm/s.
   REMARQUE: Cette eau qui se déplace lentement gardera l’eau dans le tunnel oxygénée et facilitera la récupération des animaux.
3. Laissez les animaux s’acclimater au tunnel de natation pendant 1 h.
4. Commencez l’enregistrement vidéo du comportement du poisson dans le tunnel.
   REMARQUE: Nous avons utilisé une caméra (par exemple, Yi 4K Action) avec télécommande (par exemple, Bluetooth) et enregistré la vidéo sous forme de .mpg (30 images/s).
5. Démarrer l’augmentation stepwise du débit selon le protocole expérimental choisi (1,3 cm/s dans cette étude; Figure 2).
   REMARQUE: Pour ce protocole, nous avons utilisé des taux d’écoulement faibles qui, pour le poisson zèbre, vont de 0 à 2,8 BL (longueurs corporelles)/s. Ces vitesses d’écoulement sont dans la gamme inférieure des taux d’écoulement qui induisent la natation orientée continue dans le poisson zèbre (3%-15% de la vitesse critique de natation [U_crit]). L’utilisation de faibles débits (suivant le protocole de Brett) est liée aux caractéristiques comportementales spécifiques de cette espèce en présence de courants d’eau. Le poisson zèbre a tendance à nager le long de l’axe principal de la chambre, tournant fréquemment, même en présence de débit d’eau, et ont tendance à nager à la fois en amont et en aval. Ce comportement est affecté par le débit d’eau, disparaissant à des vitesses relativement élevées (>8 BL/s), lorsque les animaux nagent continuellement en amont (réponse rhéotatique positive complète). Les déplacements verticaux et transversaux sont très rares.
6. Effectuer la morphométrie des animaux (sexe et longueur totale [TL], longueur de fourchette [FL], ou BL) sur des photos de poissons dans une chambre morphométrique.
   1. Sélectionnez l’image appropriée.
   2. Ouvrez l’image dans ImageJ.
   3. Prenez note du sexe de l’animal (le poisson zèbre mâle est mince et a tendance à être jaunâtre, tandis que les femelles sont plus arrondies et ont tendance à avoir des colorants bleus et blancs).
   4. Cliquez sur Analyser > Définir l’échelle et définir l’échelle de l’image en centimètres, en utilisant toute la longueur horizontale du tunnel comme référence.
   5. Cliquez sur Analyser > Mesurer et enregistrer la longueur linéaire de l’animal.
   6. Calculer son poids corporel (BW).
      REMARQUE: Bw est calculé à partir de relations sexe-FL-BW précédemment construites en laboratoire ou à partir de métadonnées. L’ensemble de la procédure évite le stress de manipulation sur les animaux.

Representative Results

Figure 1 : Configuration pour le contrôle du champ magnétique. (A) Rendu du tunnel de natation avec un solénoïde pour l’induction d’un champ magnétique statique et horizontal dans le tunnel. Le solénoïde (0,83 tour/cm) est relié à une unité de puissance et génère des champs de l’aire de répartition de ±250 μT (plage d’intensité qui comprend la portée du champ magnétique terrestre). Sur le côté droit, une photo du tunnel solénoïde relié à l’appareil de natation est montrée. Le tunnel est fait d’acrylique et il a deux plaques acryliques perforées placées à l’entrée d’eau, qui garantissent le flux d’être proche de laminaire. (B) Diagramme et photo des trois paires orthogonales Helmholtz définies pour le contrôle du champ magnétique dans la gamme géomagnétique des intensités. La sonde de champ magnétique, le processeur, le convertisseur numérique-analogique, et les conducteurs de bobine utilisés pour fermer la boucle sont également montrés. Chaque paire de bobines est composée de deux bobines circulaires avec un rayon(r)de 30 cm et N = 50 tours de fils de cuivre AWG-14. Un magnétomètre à trois axes (capteur) à l’échelle sélectionnable (± 88 μT à ± 810 μT) est placé près du centre de l’ensemble de bobines. La plage du capteur est définie sur des valeurs allant ±130 μT. Ces valeurs ont également été utilisées pour les mesures décrites dans les résultats représentatifs (dans ces conditions, la résolution nominale du capteur est d’environ 0,1 μT). L’intensité et la direction du champ magnétique sont contrôlées par un système de rétroaction numérique. Le capteur mesure les trois composants du vecteur de champ magnétique (les trois axes), et les signaux d’erreur correspondants sont extraits. Ensuite, les signaux de correction sont générés par un simple filtre intégrateur. Les signaux de correction numérique sont convertis en tension par un convertisseur numérique à analogique et amplifiés par un conducteur de bobine approprié. Ces derniers signaux sont utilisés pour conduire les paires Helmholtz. La fréquence d’échantillonnage est fixée à 5 Hz et la fréquence de gain d’unité des boucles est d’environ 0,16 Hz. Une fois que les courants dans les paires Helmholtz des bobines sont réglés, le champ magnétique total varie moins de 2% de sa valeur moyenne d’intensité dans le volume cubique central (avec bord [L] = 10 cm) des bobines. Pendant les mesures, le champ magnétique rms est inférieur à 0,2 μT. Dans les deux configurations (panneaux A et B),un champ électrique statique est généré par le courant dans les bobines produisant le champ magnétique. L’intensité du champ électrique est d’environ 0,4 V/m lorsque le courant maximal est appliqué; cette valeur est négligeable par rapport aux champs statiques naturels ou artificiels présents dans l’environnement dont l’intensité est de l’ordre de 1 kV/m.

Figure 2 : Diagramme des débits utilisés pendant les essais pour déterminer le seuil rhéotactic du poisson zèbre. Le débit pendant la période d’acclimation de 1 h était suffisant pour garantir un approvisionnement adéquat en oxygène aux animaux. On peut supposer qu’avec cette conception, l’approvisionnement en oxygène n’est jamais une limite, même dans la première étape de 10 min avec le flux 0. En effet, avec une teneur en oxygène de l’eau à 27 °C d’environ 7,9 mg/L et une consommation animale d’oxygène de 1 mg/h.g (une approximation excessive de la consommation d’oxygène du poisson zèbre dans des conditions routinières et à faible vitesse de baignade), il est possible de calculer qu’en l’absence de débit, le Po₂ dans le flume ne diminuera pas plus de 2 % par animal, restant bien au-dessus du Po₂ critique (environ 40 torr pour le poisson zèbre).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat