정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포가 blastocyst 단계 초기 포유류의 배아 1의 내부 세포 덩어리에서 파생된 pluripotent 세포 수 있습니다. ES 세포의 분화에 중요한 단계는 embryoid 기관의 형성 (EBS) 집계 2, 3입니다. ES 세포가 아닌 자기편 접시에서 양식 때 EB의 형성은 자연 집합을 기반으로합니다. ectoderm, mesoderm 및 endoderm 4 : 입체 EB의 recapitulates 많은 초기 포유류의 embryogenesis의 측면 및 세 세균 층에 구별.
Immunofluorescence 및 현장 하이브리드화에 널리 조직 제 5, 6, 7 세포에있는 목표 단백질 및 mRNA의 검출 기술을 사용합니다. 여기 embryoid 기관의 고품질 cryosections를 생성하는 간단한 기술을 제시한다. 이러한 접근 방식은 OCT에서 EB의 포함의 공간적 방향 cryosection 기술 다음에 의존합니다. 그 결과 섹션은 특정 단백질, RNA 또는 DNA를 포함한 세포의 인구를 특성화하기 위해 분석 절차의 다양한 받게 수 있습니다. 이러한 의미에서, EB cryosections의 준비 (10μm)은 조직학 얼룩의 분석을위한 필수 도구 (예 : Hematoxilin과 Eosin, DAPI), immunofluorescence (예 : Oct4, nestin) 또는 현장 하이브리드화에 있습니다. 이 기술은 또한 EBS의 트라이 차원 구면 구조의 유지 보수 관련하여 embryogenesis의 측면을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
1. 고정 및 Cryopreservation Pluripotent 줄기 세포는 fibroblast의 성장 인자의 20 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 및 8ng / ML (FGF – 2)와 보충 mitomycin C와 inactivated과 DMEM/F12 유지 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEF)에 교양되었습니다. EB 형성을 유도하기 위해서는 H9 세포가 아닌 자기편 요리로 전송 15 % KSR 8 보충 DMEM/F12 유지 칠일에 대한 교양되었습니다. 참고 (!) :이 기술은 모든 배아 …
Discussion
방법은 여기에 설명된 것은 제공하는 쉬운 따라 immunofluorescence 및 현장 하이브리드화 assays에 유용 embryoid 기관의 PFA 고정 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기 위해 프로토콜을. 집합체로서의 구조와 조직을 보존하면서 결과 cryosections은 인간 배아 줄기 세포의 분화의 세포 및 분자 측면의 연구를 허용합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Fundação 드 Amparo에 의해 지원되었다 Pesquisa 에스타도하나요 리우데 자네이루 (FAPERJ), Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)과 Instituto 나셔널 드 Ciência E Tecnologia (INCTC). 우리는 브루나 S. 폴슨과 EB의 이미지 앨린 M. 페르난데스에게 감사하고 있습니다.
Gomes, I. C., Acquarone, M., Maciel, R. d. M., Erlich, R. B., Rehen, S. K. Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (46), e2344, doi:10.3791/2344 (2010).