Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Эмбриональных стволовых (ЭС) клеток плюрипотентные клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты ранней стадии эмбрионов млекопитающих 1. Важный этап в дифференцировку ЭС клеток образование эмбриоидные тела (ЭТ) агрегатов 2, 3. Е. Б. Формирование на основе спонтанной агрегации, когда ES клетки культивируют в не сторонник пластин. Трехмерная резюмирует Е. Б. многие аспекты раннего эмбриогенеза млекопитающих и дифференцироваться в трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы 4.
Иммунофлуоресценции и гибридизация широко используются методы выявления целевых белков и РНК присутствуют в клетках тканей раздел 5, 6, 7. Здесь мы приведем простой метод для получения высоких cryosections качество эмбриоидных органов. Этот подход опирается на пространственную ориентацию EB вложения в октябре следуют cryosection техники. В результате разделов может быть подвергнут широкий спектр аналитических процедур для характеристики популяции клеток, содержащих определенные белки, РНК или ДНК. В этом смысле подготовка EB cryosections (10 мкм) являются необходимыми инструментами для анализа окрашивания гистологии (например, гематоксилином и эозином, DAPI), иммунофлюоресценции (например Oct4, нестин) или на месте гибридизации. Эта техника также может помочь понять аспекты эмбриогенеза в отношении поддержания три-мерной сферической структуры ЭТ.
Описанный здесь метод обеспечивает простой в последующей протокол для получения PFA фиксированных тонких срезов криостат эмбриоидные тела полезно для иммунофлуоресценции и на месте гибридизации. В результате cryosections позволяют изучать клеточные и молекулярные аспекты человеческ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро Pesquisa сделать Estado-ду-Риу-де-Жанейро (FAPERJ), Conselho Насьональ де Desenvolvimento Científico электронной Tecnológico (CNPq) и Национальным институтом Ciencia электронной Tecnologia (INCTC). Мы благодарны Бруно С. Паулсен и Алине Фернандес М. Б. для изображений.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |