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Immunology and Infection

मस्तिष्क और स्पाइनल कॉर्ड mononuclear कोशिकाओं के अलगाव Percoll gradients का उपयोग

Published: February 2, 2011 doi: 10.3791/2348

Summary

वर्तमान लेख के लिए एक तेजी से कुशलता से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों है कि प्रभावी ढंग से प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता से mononuclear कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि संक्रमण, आघात, autoimmunity, या neurodegeneration के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) घुसपैठ के अलगाव, अक्सर उनके phenotype और effector कार्यों को परिभाषित करने की आवश्यकता है. Histochemical दृष्टिकोण घुसपैठ कोशिकाओं के स्थान का निर्धारण करने के लिए और जुड़े विकृति सीएनएस विश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हैं. हालांकि, में स्वस्थानी histochemistry और immunofluorescent धुंधला तकनीक एंटीबॉडी कि एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष ऊतकों में प्रतिरक्षा सेल उपप्रकारों विशेषताएँ की संख्या द्वारा सीमित हैं. इसलिए, प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा phenotyping के साथ संयोजन के रूप में histological दृष्टिकोण को पूरी तरह से स्थानीय सीएनएस घुसपैठ की संरचना विशेषताएँ महत्वपूर्ण हैं. इस प्रोटोकॉल discontinous percoll gradients से अधिक सेलुलर निलंबन सीएनएस की जुदाई पर आधारित है. वर्तमान लेख के लिए एक तेजी से कुशलता से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों है कि प्रभावी ढंग से विभिन्न प्रवाह cytometry द्वारा एक एकल नमूने में प्रतिरक्षा सेल आबादी की पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता से mononuclear कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Protocol

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अभिकर्मकों की तैयारी

10X HBSS के एक भाग के साथ Ca बिना percoll के नौ भागों मिश्रण से तैयार शेयर isotonic percoll (एसआईपी), मस्तिष्क 4 प्रति मिलीलीटर, + + और मिलीग्राम + +.

1X HBSS में 70% से कम पीएं बिना तैयार Ca + + और मिलीग्राम + +, एक 15 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में तिरस्कृत मस्तिष्क 2 प्रति मिलीलीटर.

नोट: यह सिफारिश की है कि percoll कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, अगर ठंड में इस्तेमाल किया, कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट के लिए करते हैं और सेल जुदाई कम कुशल है.

ऊतक संग्रह और homogenization

चूहों और perfuse anesthetize ठंडा 1X HBSS के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को काटना और phenol के लाल के बिना RPMI में बनाए रखने जब तक सभी चूहों का बलिदान कर रहे हैं.

7 या 15 मिलीलीटर dounce homogenizer RPMI के 3 मिलीग्राम से युक्त में ऊतकों प्लेस, धीरे से एक ढीले ढाले मूसल (एक आकार) एक tigh फिटिंग (बी आकार) मूसल आगे ऊतकों को अलग कर देना द्वारा पीछा के साथ एक सेल निलंबन बनाने. सेल निलंबन के RPMI साथ 7 मिलीलीटर मात्रा को पूरा करें.

ग्रेडियेंट सेट अप

अंतिम 30% सिप कर सेल निलंबन के लिए एसआईपी के 3 मिलीलीटर जोड़ें

धीरे धीरे परत 70% सिप के शीर्ष पर 10 एमएल सेल निलंबन. इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम है, एक गुरुत्वाकर्षण 70% का मिश्रण और 30% समाधान से बचने मोड में सेट विंदुक सहायता का उपयोग करें. एक बहुत स्पष्ट फ्लैट लाइन 70% -30% जंक्शन पर दिखाई जानी चाहिए.

500G 18 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट अपकेंद्रित्र यकीन है कि अपकेंद्रित्र ताकि interphase परेशान नहीं है कम या कोई ब्रेक के साथ बंद.

एक हस्तांतरण pipet का प्रयोग, ट्यूब के ऊपर से धीरे मलबे की परत को हटाने और एक साफ शंक्वाकार 1X HBSS के 8 मिलीग्राम से युक्त ट्यूब में 70% -30% interphase के 2.0-3.0 मिली इकट्ठा. सुनिश्चित करें कि interphase युक्त percoll के बारे में तीन गुना पतला है, 18 में उलटा और centrifugre 7 मिनट द्वारा एक बार कुछ 500G पर मिश्रण डिग्री सेल्सियस

सेल धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर में Resuspend गोली और यह एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण और एक बार धोने 10,000 जी 1 4 मिनट डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रो अपकेंद्रित्र का उपयोग

एंटीबॉडी धुंधला

CD16/CD32 antimouse शुद्ध 50 μl में Resuspend छर्रों सेल धुंधला बफर में 1:200 पतला करने के लिए एफसी बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो.

एंटीबॉडी कॉकटेल मिश्रण और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते के 50 μl जोड़ें. प्रत्येक एंटीबॉडी पहली बार हो इष्टतम कमजोर पड़ने का आकलन titrated चाहिए. उपयुक्त fluorochrome लेजर और अपने विशेष प्रवाह cytometer के फ़िल्टर सेटिंग्स की क्षमताओं के अनुसार चुना संयोजन का उपयोग करें.

सेल धुंधला बफर, resuspend छर्रों में कोशिकाओं और सेल धुंधला बफर के 100-200 μl में धो cytometer में तुरंत विश्लेषण, या वैकल्पिक रूप से कोशिकाओं 2% (पीएफए) paraformaldehyde पीबीएस में तैयार में resuspended किया जा सकता है और 4 में संग्रहीत पर रात डिग्री सेल्सियस .

प्रतिनिधि परिणाम:

Gradients कताई के बाद, 70% -30% interphase परिभाषित सफेद प्रभामंडल है, जाना चाहिए और एक भोली माउस से बरामद कोशिकाओं के quantitation माउस प्रति 3-5 x10 5 कोशिकाओं (मस्तिष्क प्लस रीढ़ की हड्डी) उपज चाहिए . सूजन मस्तिष्क भड़काऊ सीएनएस अपमान या रोग (चित्रा 1) मॉडल के आधार कोशिकाओं की संख्या लेकर हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 भोले और EAE मस्तिष्क से mononuclear चोटी रोग में कोशिकाओं के अलगाव. मस्तिष्क की कोशिकाओं के निलंबन असंतत 70% / 30% percoll gradients पर अलग हो गए थे. कक्ष दाग एफसी - ब्लॉक के साथ incubated रहे थे बर्फ पर 30 मिनट के लिए विरोधी CD45 एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया. कक्ष सेल धुंधला बफर में rinsed थे, और एक LSR द्वितीय में 2% पीएफए ​​पूर्व अधिग्रहण में तय है. CD45 तीव्रता Y-अक्ष, जहां तीन अलग - अलग आबादी कल्पना कर रहे हैं में मापा जाता है. CD45 हाय घुसपैठ कोशिकाओं की प्रतिरक्षा phenotype के आगे लक्षण वर्णन अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग कर कार्यान्वित है और बाद में प्रवाह cytometry से विश्लेषण.

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Discussion

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सामान्य और सूजन माउस ऊतकों से सीएनएस leukocytes में सेल सतह मार्करों का विश्लेषण कई 1-3 दशकों के लिए उपयोग किया गया है. अलगाव प्रोटोकॉल घनत्व centrifugation 4 द्वारा microglia और leukocytes की जुदाई में आधारित हैं. यहाँ हम सीएनएस असंतत percoll gradients का उपयोग leukocytes को अलग करने की एक तेजी से और प्रभावी विधि का वर्णन. कोशिकाओं के अलगाव के बाद, जैसे विभिन्न एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना - के रूप में, लेकिन सीमित करने के लिए CD45 नहीं, सीडी 4, सीडी 8 CD11b, CD19, आदि प्रतिरक्षा आबादी है कि एक विशेष विकृति की प्रेरण पर सीएनएस घुसपैठ की पहचान की अनुमति देता है. विरोधी CD45 एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रवाह cytometry द्वारा तीन अलग - अलग आबादी से पता चलता है, (1) CD45 नकारात्मक neuronal कोशिकाओं astrocytes और दूसरों तंत्रिका कोशिकाओं के बीच oligodendrocytes, मिलकर जनसंख्या (2) CD45 लो या मध्यवर्ती जो ज्यादातर surveillant microglial कोशिकाओं (3) शामिल हैं CD45 उच्च जनसंख्या hematogenous leukocytes घुसपैठ की निर्वाचकगण. CNS विकृतियों के दौरान माइलॉयड कोशिकाओं के योगदान का अध्ययन चुनौतीपूर्ण किया गया है. हालांकि, सीएनएस सूजन 2, 7, 8 के दौरान माइलॉयड कोशिकाओं के कार्यात्मक भेद में विभिन्न कोशिकाओं की सतह 5 मार्करों, 6 और अस्थि मज्जा chimeric चूहों के उपयोग के संयोजन अंतर्दृष्टि से पता चला है . माइलिन पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षण पर, एक autoimmune प्रतिक्रिया प्रेरित है और रक्त कोशिकाओं के एक बड़े पैमाने पर बाढ़ मस्तिष्क के लिए भर्ती है. इस बिंदु के बाद, वहाँ विभिन्न कोशिका की सतह अणुओं की उपस्थिति के द्वारा या तो इन कोशिकाओं के phenotype, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से साइटोकिन्स या प्रतिलेखन कारकों जैसे intracellular प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी के एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची है.

जब ऊतकों homogenizing, आसानी से चरम homogenizer से निपटने सावधानी का उपयोग करें. Mononuclear phagocytes autolysis के अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं. यदि कक्षों की clumping अनुभव, एक gentler homogenization में प्रोटोकॉल अभ्यास और DNase जोड़ने homogenization बफर करने के लिए कदम के दौरान. इसलिए, अपने पृथक आबादी में मृत सेल का प्रतिशत का आकलन. इस प्रोटोकॉल आसानी से collagenase, dispase जैसे विभिन्न पचाने, दूसरों के बीच में एंजाइमों को जोड़ने के लिए संशोधित कर सकते हैं. कक्षों की उपज आमतौर पर अधिक है. हालांकि कुछ कोशिका की सतह मार्करों इस इलाज के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और इसलिए proteases द्वारा उनके विपाटन के कारण प्रवाह cytometry द्वारा अपनी सीमा का पता लगाने जाएगा. हमारे प्रोटोकॉल में, हम नियमित पचाने एंजाइमों के उपयोग से बचने, के रूप में छिड़काव समझौता के बिना संभव के रूप में जल्दी ऊतकों काटना, और बर्फ पर समय की लंबी अवधि के लिए ऊतकों (> 1hr) पूर्व homogenization छोड़ने से बचें. वर्णित प्रोटोकॉल जीन पृथक जनसंख्या का अभिव्यक्ति, प्रोटीन और सेल संस्कृति के लिए लागू होने की संभावना है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (टीए / ३०२१ - A1 एईसी टी) और सैन एंटोनियो में टेक्सास विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Tissue homogenization and Gradients

  • Percoll (Amersham)
  • 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
  • RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
  • 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)

Flow cytometry

  • Cell Staining Buffer (Biolegend)
  • Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
  • Hemacytometer (Fisher)
  • Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
  • 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
  • Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
  • Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)

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References

  1. Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
  2. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  3. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
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  8. Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
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Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).More

Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).

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