Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

Published: February 2, 2011 doi: 10.3791/2348

Summary

المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحليل تدفق cytometric.

Abstract

مطلوب في كثير من الأحيان عزل الخلايا المناعية التي التسلل الى الجهاز العصبي المركزي (CNS) خلال والعدوى المناعة الذاتية ، والصدمات النفسية أو تنكس عصبي ، لتحديد النمط الظاهري ووظائفها المستجيب. النهج النسيجية هي مفيدة لتحديد موقع الخلايا والتسلل لتحليل الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الأمراض. ومع ذلك ، محدودة في الموضع الكيمياء النسيجية وتقنيات التلوين مناعي من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتميز فرعية الخلايا المناعية في نسيج معين. ولذلك ، والنهج النسيجية بالتعاون مع phenotyping المناعة بواسطة التدفق الخلوي حاسمة لتوصيف كامل لتكوين تسلل CNS المحلية. ويستند هذا البروتوكول على الفصل بين الجهاز العصبي المركزي التعليق على مدى الخلوية التدرجات percoll discontinous. المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد مختلف السكان الخلايا المناعية في عينة واحدة بواسطة التدفق الخلوي.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إعداد الكواشف

إعداد المخزون متساوي التوتر percoll (SIP) ، و 4 مل في المخ ، عن طريق خلط 9 أجزاء من percoll مع جزء واحد من دون HBSS 10X الكالسيوم والمغنيسيوم + + + +.

إعداد المسبار في 70 ٪ في 1X HBSS دون الكالسيوم والمغنيسيوم + + + + ، 2 مل في الدماغ الاستغناء في أنبوب 15 مل المخروطية البولي بروبلين.

ملاحظة : من المستحسن أن تستخدم percoll في درجة حرارة الغرفة ، إذا ما استخدمت الباردة ، وتميل إلى الخلايا تتجمع وفصل الخلية هو أقل كفاءة.

جمع الأنسجة والتجانس

تخدير الفئران ويروي من خلال البطين الأيسر مع الثلج الباردة HBSS 1X. تشريح الدماغ والحبل الشوكي والمحافظة في RPMI دون الحمراء الفينول حتى يتم التضحية جميع الفئران.

الأنسجة مكان في 7 أو 15 مل dounce الخالط تحتوي على 3 مل من RPMI ، وجعل بلطف تعليق خلية مع مدقة فضفاضة (A الحجم) تليها مدقة tigh تركيب (B حجم) لمزيد من فصل الأنسجة. إكمال حجم الخلية تعليق إلى 7 مل مع RPMI.

مجموعة متدرجة تصل

أضف 3 مل من SIP إلى تعليق خلية لجعل SIP النهائي 30 ٪

طبقة الخلايا ببطء تعليق 10 مل على رأس SIP 70 ٪. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء ، استخدم ماصة المساعدات المنصوص عليها في وضع الجاذبية تجنب الاختلاط بين 70 ٪ و 30 ٪ الحلول. وينبغي أن يكون خط واضح جدا شقة تكون مرئية عند تقاطع 70 ٪ -30 ٪.

الطرد المركزي و 30 دقيقة في 500G 18 درجة مئوية. تأكد من أجهزة الطرد المركزي ستتوقف مع الفرامل ضئيلة جدا أو معدومة بحيث لا بالانزعاج الطور البيني.

باستخدام الماصة نقل وإزالة برفق طبقة من الأنقاض من أعلى الأنبوب ، وجمع 2،0-3،0 مل من الطور البيني بنسبة 70 ٪ -30 ٪ في أنبوب مخروطي نظيفة تحتوي على 8 مل من 1X HBSS. ضمان تضعف percoll تحتوي على نحو ثلاثة أضعاف الطور البيني ، مزيج عدة مرات من قبل وانعكاس centrifugre دقيقة 7 في 500G في 18 درجة مئوية.

Resuspend بيليه في 1 مل من العازلة تلطيخ الخلايا وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل ، ويغسل مرة أخرى باستخدام جهاز للطرد المركزي في الدقيقة 10000 دقيقة 1 G في 4 درجات مئوية.

الأضداد تلطيخ

المخفف الكريات Resuspend في 50 ميكرولتر من المنقى antimouse CD16/CD32 1:200 العازلة في تلوين الخلية لمنع المواقع التيسير ملزمة. احتضان أكثر من الثلج لمدة 10 دقيقة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

إضافة 50 ميكرولتر مزيج الكوكتيل الأضداد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. يجب أن تكون كل الأجسام المضادة معاير الأولى لتقييم التخفيف الأمثل. ملون تألقي استخدام تركيبات مناسبة اختيارها وفقا لقدرات الليزر وإعدادات التصفية من عداد الكريات الخاص تدفق معين.

غسل الخلايا في خلية تلوين العازلة ، والكريات resuspend 100-200 في ميكرولتر من تلطيخ العازلة الخلية وتحليلها على الفور في عداد الكريات ، أو بدلا من ذلك يمكن أن يكون معلق الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ (PFA) الذي أعد في برنامج تلفزيوني وتخزينها خلال الليل في 4 درجات مئوية .

ممثل النتائج :

بعد الغزل التدرجات ، ينبغي أن 70 ٪ -30 ٪ الطور البيني لديها هالة المعرفة البيضاء ، والكميات من الخلايا المستخرجة من السذاجة ماوس ينبغي ان تسفر 3-5 X10 5 خلايا في الماوس (الدماغ بالاضافة الى النخاع الشوكي). قد يكون التهاب الدماغ تتراوح أعداد الخلايا الالتهابية تبعا للإهانة أو نموذج المرض الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1).

الشكل 1
الشكل 1. عزل الخلايا وحيدة النواة ، من السذاجة وEAE المخ في مرض الذروة. تم فصل الخلايا في الدماغ أكثر من المعلقات متقطع 70 ٪ / 30 ٪ percoll التدرجات. وحضنت الخلايا ملطخة FC - تليها كتلة مضادة للCD45 الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد. وتشطف الخلايا في خلية تلوين العازلة ، والثابتة في اقتناء PFA 2 ٪ قبل LSR في الثاني. ويتم قياس كثافة CD45 في المحور Y ، حيث ثلاث مجموعات متميزة هي تصور. ويتم تنفيذ مزيد من توصيف النمط الظاهري المناعي للخلايا CD45 التسلل مرحبا به الأضداد إضافية وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد استخدمت تحليلات علامات سطح الخلية في الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض من الأنسجة الملتهبة والفأر العادي لعدة عقود 1-3. وتستند بروتوكولات العزل في فصل الخلايا الدبقية الصغيرة والكريات البيض بنسبة 4 الطرد المركزي الكثافة. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة لعزل الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض باستخدام التدرجات percoll متقطع. بعد عزل الخلايا ، وتلطيخ مع أضداد مختلفة مثل ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، CD45 ، CD4 ، CD8 ، CD11b ، CD19 ، وما إلى ذلك يسمح بتحديد هوية السكان المناعية التي التسلل الى الجهاز العصبي المركزي بناء على تحريض من أمراض معينة. تلطيخ المضادة للأضداد CD45 يكشف عن ثلاث مجموعات متميزة من خلال التدفق الخلوي ؛ (1) CD45 السكان السلبية التي تتكون من الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية وoligodendrocytes بين الخلايا العصبية الأخرى ، (2) CD45 الصغرى أو المتوسطة والتي تحتوي على خلايا دبقية surveillant في الغالب ، (3) CD45 مرحبا السكان تتألف من الكريات البيض التسلل الدموي. دراسة مساهمة خلايا الدم النخاعي خلال أمراض الجهاز العصبي المركزي وقد تم الصعبة. ومع ذلك ، فقد أظهرت مزيجا من مختلف علامات سطح خلايا 5 و 6 و استخدام الفئران نخاع العظم خيالية نظرة ثاقبة الفروق الوظيفية للخلايا الدم النخاعي خلال التهاب الجهاز العصبي المركزي 2 ، 7 ، 8. على التحصين مع الببتيدات الميلين ، والناجم عن رد فعل المناعة الذاتية ، ويتم تجنيد تدفق أعداد كبيرة من خلايا الدم الى الدماغ. بعد هذه النقطة ، هناك ذخيرة واسعة من الأجسام المضادة المتاحة لدراسة النمط الظاهري من هذه الخلايا إما من خلال وجود جزيئات سطح الخلية المختلفة ، فضلا عن التعبير عن البروتينات داخل الخلايا مثل السيتوكينات أو عوامل النسخ.

عند المجانسة الأنسجة ، توخي الحذر الشديد في التعامل مع الخالط مع سهولة. البالعات وحيدات النوى هي عرضة للانحلال ذاتي. إذا تعاني من التثاقل من الخلايا ، والممارسة على بروتوكول ألطف التجانس وإضافة إلى الدناز العازلة خلال الخطوة التجانس. ولذلك ، وتقييم نسبة السكان في خلية ميتة الخاص معزولة. ويمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لإضافة أنزيمات الهضم المختلفة ، مثل كولاجيناز ، dispase من بين آخرين. العائد من الخلايا عادة ما يكون أعلى. لكن بعض علامات سطح الخلية عرضة لهذا العلاج ، وبالتالي سيحد من خلال الكشف عن التدفق الخلوي بسبب تفككها بواسطة البروتياز. في بروتوكول لدينا ، ونحن بشكل روتيني تجنب استخدام إنزيمات هضم ، تشريح الأنسجة في أسرع وقت ممكن دون المساس التروية ، وتجنب ترك الأنسجة لفترات طويلة من الوقت على الجليد (> 1hr) التجانس السابقة. بروتوكول صفها لديه القدرة على أن تطبق على ثقافة التعبير ، والبروتين والخلايا الجينات المعزولة من السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الوطنية لمرض التصلب العصبي المتعدد (TA 3021 - A1 / T لAEC) وجامعة تكساس في سان انطونيو.

Materials

Tissue homogenization and Gradients

  • Percoll (Amersham)
  • 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
  • RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
  • 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)

Flow cytometry

  • Cell Staining Buffer (Biolegend)
  • Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
  • Hemacytometer (Fisher)
  • Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
  • 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
  • Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
  • Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
  2. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  3. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  4. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  5. Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
  6. Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. (2010).
  7. Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
  8. Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).More

Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter