المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحليل تدفق cytometric.
Abstract
مطلوب في كثير من الأحيان عزل الخلايا المناعية التي التسلل الى الجهاز العصبي المركزي (CNS) خلال والعدوى المناعة الذاتية ، والصدمات النفسية أو تنكس عصبي ، لتحديد النمط الظاهري ووظائفها المستجيب. النهج النسيجية هي مفيدة لتحديد موقع الخلايا والتسلل لتحليل الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الأمراض. ومع ذلك ، محدودة في الموضع الكيمياء النسيجية وتقنيات التلوين مناعي من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتميز فرعية الخلايا المناعية في نسيج معين. ولذلك ، والنهج النسيجية بالتعاون مع phenotyping المناعة بواسطة التدفق الخلوي حاسمة لتوصيف كامل لتكوين تسلل CNS المحلية. ويستند هذا البروتوكول على الفصل بين الجهاز العصبي المركزي التعليق على مدى الخلوية التدرجات percoll discontinous. المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد مختلف السكان الخلايا المناعية في عينة واحدة بواسطة التدفق الخلوي.
Protocol
إعداد الكواشف إعداد المخزون متساوي التوتر percoll (SIP) ، و 4 مل في المخ ، عن طريق خلط 9 أجزاء من percoll مع جزء واحد من دون HBSS 10X الكالسيوم والمغنيسيوم + + + +. إعداد المسبار في 70 ٪ في 1X HBSS دون الكالسيوم والمغ?…
Discussion
وقد استخدمت تحليلات علامات سطح الخلية في الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض من الأنسجة الملتهبة والفأر العادي لعدة عقود 1-3. وتستند بروتوكولات العزل في فصل الخلايا الدبقية الصغيرة والكريات البيض بنسبة 4 الطرد المركزي الكثافة. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الوطنية لمرض التصلب العصبي المتعدد (TA 3021 – A1 / T لAEC) وجامعة تكساس في سان انطونيو.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Percoll (Amersham)
10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
Cell Staining Buffer (Biolegend)
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).