Summary
Saponina permeabilizzate preparazione fibra in collaborazione con respirometrico analisi fosforilazione ossidativa fornisce una valutazione integrativa della funzione mitocondriale. Respirazione mitocondriale in stati fisiologici e patologici possono riflettere varie influenze normative ivi comprese le interazioni mitocondriale, morfologia e biochimica.
Abstract
Indagine della funzione mitocondriale rappresenta un importante parametro di fisiologia cardiaca come i mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico, stress ossidativo, apoptosi, invecchiamento, encefalomiopatie mitocondriali e la tossicità dei farmaci. Detto questo, le tecnologie per misurare la funzione mitocondriale cardiaco sono molto richiesti. Una tecnica che si avvale di un approccio integrato per misurare la funzione mitocondriale è respirometrico fosforilazione ossidativa (OXPHOS) analisi.
Il principio di valutazione respirometrico OXPHOS è incentrata la misurazione della concentrazione di ossigeno utilizzando un elettrodo di Clark. Mentre il fascio di fibre permeabilizzate consuma ossigeno, concentrazione di ossigeno nel declina camera chiusa. Utilizzando selezionati substrato-inibitore-disaccoppiatore protocolli di titolazione, gli elettroni sono forniti a siti specifici della catena di trasporto degli elettroni, che consentono la valutazione della funzione mitocondriale. Tecniche di preparazione prima dell'analisi respirometrico della funzione mitocondriale, meccanici e chimici sono utilizzati per permeabilize il sarcolemma delle fibre muscolari. Permeabilizzazione chimica impiega saponina per perforare modo selettivo la membrana cellulare, pur mantenendo l'architettura cellulare.
Questo documento descrive accuratamente le fasi del processo di preparazione di fibre cardiache saponina di pelle per le misure di consumo di ossigeno per valutare OXPHOS mitocondriale. Inoltre, la risoluzione dei problemi indicazioni, nonché a specifici substrati, inibitori e uncouplers che possono essere utilizzati per determinare la funzione dei mitocondri in siti specifici della catena di trasporto degli elettroni sono forniti. È importante sottolineare che il protocollo descritto può essere facilmente applicata al tessuto cardiaco e scheletrico di vari modelli animali e campioni umani.
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- La soluzione di rilassamento e la conservazione (RP Solution) è preparato come descritto in precedenza, con piccole modifiche 1. In breve, la soluzione RP è composto da 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 mM imidazolo, 0.5MM ditiotreitolo, taurina 20 mM, 50 mM K-MES, 6,56 MgCl 2, 5.7mm ATP, fosfocreatina 14.3mM, pH 7,1, aggiustato a temperatura ambiente (RT). Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,45 micron per sterilizzare. Dividere in 15 ml (Falcon tubi in polipropilene) e conservare a -20 ° C Vedi la discussione per le ricette.
- La soluzione respirometria mitocondriale (MiR05) è preparato come descritto in precedenza 2 e contiene EGTA 0,5 mm, 3mm MgCl 2 .6 H 2 O, taurina 20 mM, 10mM KH 2 PO 4, HEPES 20mm, 1 g / L BSA, 60mm potassio lactobionate, 110mm saccarosio, pH 7.1, regolato a 30 ° C. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,45 micron per sterilizzare. Dividere in 50 ml (Falcon tubi in polipropilene) e conservare a -20 ° C. Si veda la discussione per le ricette. Il fattore di solubilità dell'ossigeno per MiR05 a 30 ° C e 37 ° C è 0,92 3.
2. Preparazione dei tessuti
A. cardiaca fibre preparazione meccanica
- Procedure sono state approvate dalla University of Animal Care Calgary e Usa Comitato e rispettare l'Associazione canadese per le linee guida Animal Science Laboratory per la sperimentazione.
- Dislocazione cervicale di immobilizzare il mouse è il metodo preferito. In alternativa, intraperotineal (IP) l'inserimento di ketamina e xilazina (80 e 10mg/kg, rispettivamente) o 0.5mg/kg di sodio pentobarbital può essere somministrato. Nota: sodio pentobarbital è un inibitore reversibile della NADH deidrogenasi (complesso I) 4.
- Rimuovere il cuore e mettetelo in una petri-piatto contenente la soluzione RP su ghiaccio (figura 1A). Rimuovere con cautela qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso utilizzando un microscopio di dissezione.
- Tagliare il cuore a metà lungo il setto. Dell'accisa 10-25mg di peso fresco (ww) del tessuto tagliando dalla superficie dell'endocardio del ventricolo sinistro (Figura 1B). Garantire incisione è lungo l'orientamento delle fibre per minimizzare i danni meccanici miocardio.
- Posizionare il sezionato, sottocampione di tessuto in un apposito Petri-piatto contenente la soluzione RP sul ghiaccio. Utilizzando un microscopio a dissezione tagliare il cuore a strisce longitudinali orientamento delle fibre con un diametro di 1-1,5 mm.
- Accorciare le strisce con un bisturi a lunghezze di 2-4mm (Figura 1C).
- Usando estrema cura e pinze taglienti meccanicamente fasci di fibre separate. Fasci di fibre finale deve contenere un massimo di 6-8 fibre, collegati da piccole aree di contatto, del peso di non più di 5mg ww. Fibre cardiache di 1-3mg ww sono raccomandati. Visivamente, il tessuto cardiaco dovrebbe cambiare dal rosso originale per una colorazione rosa pallido (Figura 1D).
B. cardiaca fasci di fibre chimiche preparazione
- Posizionare un 12-pozzetti sul ghiaccio.
- Sciacquare bene la (s) con la soluzione RP per minimizzare la contaminazione di calcio 5.
- Trasferire i fasci di fibre meccanicamente preparati a un pozzo contenente 3 ml ghiacciato soluzione RP con 50ug / mL saponina. Nota: la concentrazione di saponina non dipende dalla quantità di muscolo cardiaco presenti nella soluzione.
- Incubare per 20 minuti mescolando miti sul ghiaccio.
C. cardiaca fibra di lavaggio Bundle
- Risciacquare un nuovo pozzo con MiR05 per minimizzare la contaminazione di calcio 5.
- Trasferire i fasci cardiaco al 10 ml nuovo pozzetto contenente ghiacciata MiR05. Incubare per 10 minuti mescolando miti sul ghiaccio.
- Ripetere (1-2) 2-3 volte con fresca MiR05. Le fasi di lavaggio ripetitivi sono per garantire la rimozione o saponina, ATP, ADP e qualsiasi substrato rimanente dal fasci di fibre.
D. determinazione del peso umido
- Direttamente prima dell'analisi delle vie respiratorie, peso umido si ottiene tamponando i fasci di fibre individuali (1-3mg ww) su una superficie assorbente (carta da filtro) con pinze e tenendo la fibra in superficie per 5 secondi o fino a quando tutta l'umidità è malvagio distanza.
- Utilizzando un'altra superficie assorbente, rimuovere il liquido in eccesso dal forcipe.
- Tarare la scala e posizionare il fascio di fibre di plastica pesa su un battello per la misura di massa.
- Trasferire il fascio di fibre cardiache di un nuovo pozzo con gelida MiR05. Il fascio di fibre è pronto per la valutazione del consumo di ossigeno.
3. Respirometriche OXPHOS Analisi
A. Attrezzatura respirometriche
- Il laboratorio utilizza e raccomanda una camera a due titolazioni a iniezione oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Il Oxygraph 2-k offre respirometria ad alta risoluzione in gran parte utilizzando hardware e software strumentali (DatLab) che minimizza strumentale di sottofondo che contribuiscono allaconsumo di ossigeno artefatti.
- La taratura del oxygraph è un passo essenziale per minimizzare gli effetti confondenti del consumo di ossigeno strumentale. Calibrazione varia leggermente a seconda del oxygraph. Fare riferimento al manuale oxygraph per procedure specifiche.
B. Rappresentante Controllo Qualità / Validazione Tecnica protocollo
- Garantire MiR05 è stato aggiunto alla casa oxygraph camere i sensori di ossigeno polarografico (POS) e dare un tempo adeguato per la saturazione dell'aria ed equilibratura del MiR05 a 37 ° C prima di mettere le fibre murino cardiaco nelle camere oxygraph.
- I campioni di fibre cardiache vengono inseriti nella suscitato MiR05 delle camere oxygraph. Nota: Assicurarsi che le barre sono mescolate PVDF o PEEK rivestiti bar agitatore (diametro 6 mm).
- Utilizzando un ossigeno siringa, aumentare la concentrazione di ossigeno delle Camere oxygraph a 250-550uM. Va notato che la concentrazione di ossigeno è limitante per la preparazione di fibre permeabilizzate anche al 50% sopra l'aria di saturazione 6. Lasciare 5-10min per la stabilizzazione concentrazione di ossigeno.
- Con una microsiringa 25μL Hamilton, aggiungere 10μL di glutammato 2M e 5μL di 800mm malato per ottenere una concentrazione finale di 10 mm e 2 mm, rispettivamente. Queste titolazioni consentire la determinazione del complesso basale ho supportato la respirazione (Stato 2; assenza di ADP). Flusso di ossigeno dovrebbe stabilizzarsi entro circa 5min di titolazione. Preparazione dovrebbe fornire molto riproducibile stato 2 il consumo di ossigeno.
- A seguito di 2-5min di consumo di ossigeno stabile, aggiungere 20μL di ADP 500mm per una concentrazione finale di 5 mm (saturazione), con una microsiringa 25μL Hamilton, per la massima (stato 3) la respirazione mitocondriale attraverso complessi studi I. Pochi utilizzare questo alto di una concentrazione di ADP, tuttavia, è importante notare che oltre il 90% di saturazione è raggiunto solo a concentrazioni superiori 5mM 7.
- A seguito di 2-5min di consumo di ossigeno stabile, aggiungere 5μL di 4mm citocromo c per ottenere una concentrazione finale di 10μM, con una microsiringa 10μL Hamilton, per l'analisi del controllo di qualità esterno della membrana mitocondriale (OMM) integrità.
- A seguito di 2-5min di consumo di ossigeno stabile, aggiungere 1ml di 4 mg / mL oligomicina, con una microsiringa 10μL Hamilton, per inibire ATP sintasi. Questa fase di titolazione offrirà validazione di integrità della membrana interna dei mitocondri.
- In seguito alla valutazione respirometrico OXPHOS. Il campione viene conservato per la determinazione del peso secco o marcatore mitocondriale.
- Rimuovere MiR05 dalle camere di vetro del oxygraph. Lavare le camere di almeno tre volte con acqua distillata (DDH 2 O).
- Lavare le camere di almeno tre volte con il 100% di etanolo (EtOH) per rimuovere EtOH-inibitori solubili come oligomicina.
- Lavare le camere con il 70% EtOH tre volte con la finale EtOH 70% della durata di 30min lavare per sterilizzare le camere oxygraph.
- Prima dell'aggiunta di MiR05 per i nuovi protocolli sperimentali titolazione garantire le camere che contiene il POS sono lavati almeno cinque volte con DDH 2 O.
- Le titolazioni convalida può essere eseguita come un determinato protocollo (Figura 2) o le titolazioni possono essere inclusi in una ben pianificata protocollo di titolazione a seconda della finalità sperimentali e diagnostiche degli studi respirometria.
4. Rappresentante dei risultati:
Il consumo di ossigeno nel adeguatamente preparati fibre murino cardiaca viene valutata dal protocollo di controllo di qualità, come mostrato nella Figura 2. Figure 3-5 fornire esempi comunemente incontrati su preparato in modo errato fibre cardiache. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) rappresenta un indice importante in respirometria. Questo parametro indica l'accoppiamento tra consumo di ossigeno e fosforilazione ossidativa. Nelle preparazioni fibra permeabilizzate, la RCR è il tasso di respirazione in stato di 3 rispetto allo stato 2 o, in alternativa stato 3 stato sopra 4 (indotto da oligomicina e / o atractyloside, ATR). Inoltre, RCR può essere utilizzato come marcatore di assicurazione della qualità e in grado di identificare i cambiamenti in abbinamento risultanti dagli interventi sperimentali patologici o 5. Ben accoppiato permeabilizzate preparati cardiaci murini produrre un RCR tra 3-6 a seconda della soluzione di incubazione utilizzato 1, 8, 9.
La titolazione del citocromo c è usato come una conferma della corretta preparazione dei tessuti. Citocromo c è una proteina localizzata nello spazio intermembrana a livello della membrana mitocondriale interna 10. Quando la membrana esterna dei mitocondri è intatta, il endogeno citocromo c rimane nello spazio intermembrana e la titolazione delle esogene citocromo c ha un effetto trascurabile sulla respirazione (Figura 2). Se la membrana esterna dei mitocondri è danneggiato, il citocromo c endogena può essere rilasciato dallo spazio intermembrana e inibire la respirazione fino esogeni citocromoInoltre c (Figura 3). Ai preparativi dovrebbe esperienza solo un lieve aumento del flusso di ossigeno a seguito Inoltre citocromo c nel range 5-15% 5. Inoltre, questo permette di titolazione sperimentale per la valutazione dell'influenza del fattore di stress patologico o sperimentale sulla integrità della membrana mitocondriale esterna. Se un effetto di citocromo c è vissuto, garantire cure durante la preparazione meccanica del / o tessuti e ridurre la concentrazione di saponina.
L'aggiunta di oligomicina e / o ATR è utilizzato per valutare le alterazioni della respirazione perdite; consumo di ossigeno, non contribuiscono alla fosforilazione di ADP 11. Inoltre, questa fase di titolazione può essere utilizzato come una convalida di preparazione del campione adeguata. Fibre di controllo o wild-type dovrebbe essere sensibili a questa aggiunta e sperimentare una significativa riduzione del flusso di ossigeno. Un RCR basso e la sensibilità ridotta a oligomicina e / o ATR con conseguente flusso di ossigeno relativamente elevato indica un danno alla membrana interna dei mitocondri durante la preparazione (Figura 4). Il danno è probabilmente indotta durante la separazione meccanica delle fibre cardiache, come la membrana mitocondriale interna è meno suscettibile di insultare da saponina rispetto alla membrana esterna mitocondriale. Tuttavia, sia la preparazione meccanica e chimica può dover essere adeguato di conseguenza per evitare fibre cardiache preparati impropriamente 5, 12.
La saponina fasci di fibre dalla pelle di topi non devono rimanere nella soluzione RP per più di 6 ore o il MiR05 soluzione per più di 2 ore. La mancanza di risposta al substrato-inibitore-disaccoppiatore titolazioni come si vede in figura 5 può essere indicativo dei periodi di incubazione prolungato. Successivi sforzi devono ridurre al minimo i periodi tra il sacrificio animale e misurazione del consumo di ossigeno.
Figura 1. Preparazione meccanica del murino fasci di fibre cardiache. A. Il cuore intero dissezione subito dopo. B. Un 10-25mg campione del ventricolo sinistro anteriore. C. tessuto cardiaco separati in diametro di 1 mm e 2-4mm strisce di lunghezza. D. fasci di fibre cardiache finale pronto per la permeabilizzazione chimica con saponina.
Figura 2. I risultati rappresentativi di preparazione dei tessuti corretto utilizzo valutazione polarografiche. I 2 flusso di ossigeno è stato supportato da complesso I substrati glutammato e malato (M / G) ed è significativamente stimolato dopo l'aggiunta di ADP (stato 3). Nessun effetto stimolante di oltre esogeni citocromo c indica la membrana esterna mitocondriale è intatto. Sensibilità del consumo di ossigeno per oligomicina suggerisce l'integrità membrana mitocondriale interna è intatta. Concentrazione di ossigeno in una camera a 2 ml chiuso è identificato dalla linea blu. Il consumo di ossigeno del campione di tessuto cardiaco in una camera a 2 ml chiuso è rappresentata dalla linea rossa. Malate e glutammato, M / G; adenosina difosfato, ADP; citocromo c, Cyto c; oligomicina, o.
Figura 3. Citocromo c convalida di test effetto utilizzando valutazione polarografiche. I 2 flusso di ossigeno è stato supportato da complesso I substrati glutammato e malato (M / G) ed è significativamente stimolato dopo l'aggiunta di ADP (stato 3). Effetto stimolante di oltre esogeni citocromo c indica l'integrità esteriore della membrana mitocondriale è compromessa. Concentrazione di ossigeno in una camera a 2 ml chiuso è identificato dalla linea blu. Il consumo di ossigeno del campione di tessuto cardiaco in una camera a 2 ml chiuso è rappresentata dalla linea rossa. Malate e glutammato, M / G; adenosina difosfato, ADP; citocromo c, c. Cyto
Figura 4. Interiore test di integrità della membrana mitocondriale convalida utilizzando valutazione polarografiche. I 2 flusso di ossigeno è stato supportato da complesso I substrati glutammato e malato (M / G) e una stimolazione relativamente debole del consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di ADP (stato 3). Scarsa sensibilità del consumo di ossigeno per oligomicina suggerisce la membrana mitocondriale interna è danneggiato. Concentrazione di ossigeno in una camera a 2 ml chiuso è identificato dalla linea blu. Il consumo di ossigeno del campione di tessuto cardiaco in una camera a 2 ml chiuso è rappresentata dalla linea rossa. Malate e glutammato, M / G; adenosina difosfato, ADP oligomicina, o.
Figura 5. Polarografici valutazione dopo l'incubazione prolungata MiR05. Il consumo di ossigeno è insensibile alle aggiunta esogena di glutammato e malato (M / G) e il consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di ADP (Stato 3) è ridotto. Non vi è alcun effetto stimolante di oltre esogeni citocromo c e l'insensibilità del consumo di ossigeno per oligomicina è vissuto. La mancanza di risposta alle aggiunte alla soluzione di incubazione extramitochondrial suggerisce mitocondriale stabilità funzionale è compromessa. Concentrazione di ossigeno in una camera a 2 ml chiuso è identificato dalla linea blu. Il consumo di ossigeno del campione di tessuto cardiaco in una camera a 2 ml chiuso è rappresentata dalla linea rossa. Malate e glutammato, M / G; adenosina difosfato, ADP; citocromo c, c. Cyto
1. Note: Preparazione dei reagenti
Preparazione del K 2 soluzione stock EGTA 100mM
| Nome del reagente | Concentrazione finale (mM) | g/100 ml H 2 O |
| Glicole etilenico-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Idrossido di potassio (KOH) | 200 | 1,15 |
Nota: Regolare il pH a 7,4 a temperatura ambiente.
Preparazione di Ca 2 soluzione stock EGTA 100mM
| Nome del reagente | Concentrazione finale (mM) | g/100 ml H 2 O | Commenti (opzionale) |
| Glicole etilenico-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA) | 100 | 3,805 | Di calore a 80 ° C e mescolare dolcemente. |
| Carbonato di calcio (CaCO 3) | 100 | 1,001 | La concentrazione di calcio deve essere preciso come il calcio regola la funzione di organelli diversi tra cui i mitocondri. Garantire solubilizzazione completa di tutti i CaCO 3. La soluzione finale deve essere completamente trasparente. CaCO 3 è inizialmente misto con EGTA e po 'd'acqua per attivare la formazione di acido carbonico e CO 2 evaporazione. Questa reazione può essere accelerata da riscaldamento fino a 80 ° C. |
| Idrossido di potassio (KOH) | 200 | 1,15 | Neutralizzare con KOH dopo l'evaporazione di CO 2 è stata completata. |
Nota: Regolare il pH a 7,4 a temperatura ambiente.
Preparazione di rilassamento e soluzione Preservation (Soluzione RP) 1
| Reagente | Concentrazione finale (mM) | Per litro | Commenti |
| K 2 EGTA | 7,23 | 72,3 mL | |
| CAK 2 EGTA | 2,77 | 27,7 mL | |
| Imidazolo | 20 | 1.36g | |
| Ditiotreitolo | 0,5 | ||
| La taurina | 20 | 2.52g | |
| Adenosina 5'-trifosfato disodico sale idrato (ATP) | 5,7 | 3.14g | |
| Fosfocreatina (PCr) | 14,3 | 4,0 G | |
| Cloruro di magnesio (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
Nota: Regolare il pH a 7,1 a temperatura ambiente
Preparazione della soluzione respirometria mitocondriale (MiR05 Soluzione) 2
| Reagente | Concentrazione finale (mM) | Per litro | Commenti (opzionale) |
| Glicole etilenico-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA) | 0,5 | 0.190g | Utilizzato come chelante del calcio |
| Magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2 .6 H 2 O) | 3,0 | 0.610g | La qualità della preparazione delle fibre non possono essere testati senza Mg 2 +. |
| La taurina | 20,0 | 2.502g | La Taurina è un antiossidante e stabilizzatore di membrana. 20 mM è la concentrazione intracellulare presente nel cuore. |
| Potassio fosfato monobasico (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Potassio-lactobionate | 60,0 | 120 ml di 0,5 M K-lactobionate stock | 0.5M K-lactobionate magazzino: Aggiungere 35,83 g di acido lattobionico a 100 mL H 2 O e il pH a 7,0 a temperatura ambiente. Regolare il volume a 200 ml con DDH 2 O. Utilizzata per replicare ad alta concentrazione intracellulare di K +. KCl è stato utilizzato in precedenza, tuttavia, l'alta Cl-inibisce la funzione mitocondriale di creatin-chinasi. |
| Saccarosio | 110,0 | 37.65g | Usato come scavenger di ROS. |
| Sieroalbumina bovina (BSA) | 1 g / L | 1g | Utilizzato come stabilizzatore di membrana, antiossidante e chelante del calcio e acidi grassi liberi. |
Nota: Regolare il pH a 7,1 a 30 ° C
3. Note: respirometriche Analisi OXPHOS
B. Selezionare Substrati, uncouplers e inibitori
Lista dei substrati selezionati per l'analisi mitocondriale respirometria
| Substrato | [Archivi] | Preparazione | Volume per 2 ml | [Final] | Commenti |
| Adenosina 5'-difosfato sale diidrato monopotassico (ADP) | 500mm | 246mg / ml DDH 2 O. Regolare il pH a 7,1 a temperatura ambiente. Conservare a -80 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 20 ul | 5mM | Per mantenere costante Mg 2 + + durante gli esperimenti respirometria aggiungere 0,6 mol MgCl 2 / mol ADP. |
| Ascorbato | 800mm | 0.1584g / mL DDH 2 O. Conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. Sensibile alla luce | 5 microlitri | 2mM | Agisce come substrato quando viene utilizzato in parallelo con TMPD. Deve correggere per il flusso di ossigeno per l'auto-ossidazione. |
| Citocromo C | 4mm | 50 mg / mL DDH 2 O. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 5 microlitri | 10um | |
| Carbonile cianuro p-(trifluoromethoxy) fenilidrazone (FCCP) | 0.1mm | 0.254mg/10 ml di EtOH 100%. Conservare in fiale di vetro a -20 ° C in 500 microlitri aliquote. | Passi di 1 ml | Agisce come un disaccoppiatore. Determina la massima capacità di trasporto degli elettroni e qualsiasi limitazione di trasporto degli elettroni dal sistema di fosforilazione. | |
| Glutammato | 2M | 0.3742g / mL DDH 2 O. Regolare il pH a 7,1 a temperatura ambiente. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 10ul | 10mM | Agisce come substrato per NADH deidrogenasi (complesso I). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / mL DDH 2 O. Regolare il pH a 7,1 a temperatura ambiente. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 5UL | 2mM | Agisce come substrato per NADH deidrogenasi (complesso I). Non può sostenere da sola respirazione. |
| Piruvato | 1M | 11mg/0.1 mL DDH 2 O. Preparare freschi. | 5 microlitri | 2,5 mm | Agisce come substrato per NADH deidrogenasi (complesso I). |
| Succinato | 1000mm | 1.3505g / 5 ml DDH 2 O. Regolare il pH a 7,1 a temperatura ambiente. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 20 ul | 10mM | Agisce come substrato per succinato deidrogenasi (complesso II). |
| N, N, N ', N'-Tetramethyl- pphenylenediamine Dicloridrato (TMPD) | 200mm | 47.1mg / mL DDH 2 O. Aggiungi ascorbato 0,8 M a una concentrazione finale di 10 mm per evitare l'auto-ossidazione Conservare a -20 ° C in aliquote da 200 microlitri. | 5 microlitri | 0.5MM | Autossidazione di soluzione evidente dalla comparsa di colorazione blu. Agisce come substrato quando viene utilizzato in parallelo con TMPD. Deve correggere per il flusso di ossigeno per l'auto-ossidazione. |
Elenco degli inibitori selezionati per l'analisi mitocondriale respirometria
| Substrato | [Archivi] | Preparazione | Volume per 2 Camera mL | [Final] | Commenti |
| Un antimicina | 5mM | 27.4mg/10 ml di EtOH 100%. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 1 ml | 2.5μM | Inibitore di coenzima Q: citocromo c ossidoreduttasi (Complesso III) </ Td> |
| Atractyloside | 50mM | 40 mg / mL DDH 2 O. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. | 30 microlitri | 0.75mm | Inibitore della ATP sintasi. |
| Oligomicina | 4 mg / mL | 4 mg / mL di EtOH 100%. Conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. | 1 ml | Inibitore della ATP sintasi. | |
| Cianuro di potassio | 1M | 65.1mg / mL DDH 2 O. Preparare freschi. Regolare il pH a 7,1 a RT | 1 ml | 1 mM | Inibitore del citocromo c ossidasi (complesso IV). Utilizzare TMPD seguente titolazione e ascorbato di accedere autossidazione. |
| Rotenone | 0.1mm | 0.39mg/10 ml di EtOH 100%. Conservare a -20 ° C in aliquote da 250 microlitri. Sensibile alla luce. | 1 ml | 0.05μM | Inibitore della NADH deidrogenasi (complesso I). Concentrazioni più elevate può essere richiesto, comunque, per ridurre la ritenzione rotenone in camera di iniziare, come indicato. |
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Discussion
La saponina permeabilizzate tecnica fibra cardiaca offre un compromesso tra le uniche in vitro e in vivo, la valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale OXPHOS. I vantaggi di questa tecnica includono una maggiore rilevanza fisiologica rispetto ai mitocondri isolati come architettura cellulare è conservata. Mentre la membrana plasmatica è degradata, strutture a membrana intracellulari tra cui i mitocondri 12, 14, reticolo sarcoplasmatico 14, miofilamenti e il citoscheletro 1, 17 rimangono intatti. Inoltre, le interazioni tra mitocondri e citoscheletro 1, 17 sono inalterati. Mitocondri nelle fibre permeabilizzate mostrano una maggiore stabilità. Preparati in fibra di roditori possono essere memorizzati in ghiacciata soluzioni conservazioni per i campioni di fibre 6h e umana mostrano la stabilità per un massimo di 24 ore 18,2. Esperienza equilibrio mitocondri rapido con la soluzione di incubazione. Questo consente un controllo diretto su sito-specifica analisi della catena di trasporto degli elettroni in risposta a substrati aggiunto, inibitori e uncouplers 1, 5. Inoltre, questa tecnica in situ richiede solo pochi milligrammi di tessuto.
Limitazioni della saponina dalla pelle in fibra tecnica non può essere ignorato. Mitocondri cardiaci sono eterogenei, costituiti da due sottopopolazioni;. Subsarcolemmale e interfibrillari in situ respirometria mitocondriale valuta la popolazione totale dei mitocondri, senza la capacità di distinguere tra le sottopopolazioni 5. Inoltre, vari metaboliti cellulari e fattori citosolici regolano la funzione mitocondriale. Questi componenti citosolico delle fibre cardiache sono persi durante il processo di permeabilizzazione con conseguente impossibilità di valutare mitocondriali presso l'esatta in un ambiente vivo 5.
Questioni di rendicontazione sono una preoccupazione importante. Misurazione del consumo di ossigeno può essere espressa per peso umido oa secco, tuttavia, la densità mitocondriale è un fattore importante nella eterogeneità del flusso respiratorio quando espresso per massa di tessuto 7. E 'importante capire che l'interpretazione della frequenza respiratoria e le variazioni sono fortemente influenzati dalla scelta dello stato di riferimento. Per i confronti diretti di respirometrico risultati OXPHOS in fibre permeabilizzate, tassi devono essere espresse in relazione ad un indicatore di riferimento comune come il DNA mitocondriale, citrato sintasi, l'attività del citocromo c ossidasi, e / o contenuti aa3 citocromo 19.
In sintesi, la preparazione delle fibre permeabilizzate utilizzato in combinazione con l'analisi respirometria consente la valutazione della funzione integrativa dei mitocondri cardiaci. Diversi stati patologici e modelli genetici hanno utilizzato questa tecnica. Questi includono la valutazione di tossicità indotta da farmaci, invecchiamento, diabete, insufficienza cardiaca congestizia, lesioni ischemiche e stress ossidativo mitocondriale sulla fisiologia 5, 20. Diversi ottime recensioni metodologico e manoscritti della saponina permeabilizzate tecnica di fibre e polarografico valutazione del consumo di ossigeno sono stati precedentemente pubblicati 1, 5, 14, 20 e sono altamente raccomandati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research e Genome Canada. JS detiene premi stipendio sostegno della Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada e la Canadian Diabetes Association. Il laboratorio vuole riconoscere l'assistenza tecnica di strumenti Oroboros durante l'acquisizione di saponina permeabilizzate tecnica di fibra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L.
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G.
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
