Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate
Summary
Saponina permeabilizzate preparazione fibra in collaborazione con respirometrico analisi fosforilazione ossidativa fornisce una valutazione integrativa della funzione mitocondriale. Respirazione mitocondriale in stati fisiologici e patologici possono riflettere varie influenze normative ivi comprese le interazioni mitocondriale, morfologia e biochimica.
Abstract
Indagine della funzione mitocondriale rappresenta un importante parametro di fisiologia cardiaca come i mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico, stress ossidativo, apoptosi, invecchiamento, encefalomiopatie mitocondriali e la tossicità dei farmaci. Detto questo, le tecnologie per misurare la funzione mitocondriale cardiaco sono molto richiesti. Una tecnica che si avvale di un approccio integrato per misurare la funzione mitocondriale è respirometrico fosforilazione ossidativa (OXPHOS) analisi.
Il principio di valutazione respirometrico OXPHOS è incentrata la misurazione della concentrazione di ossigeno utilizzando un elettrodo di Clark. Mentre il fascio di fibre permeabilizzate consuma ossigeno, concentrazione di ossigeno nel declina camera chiusa. Utilizzando selezionati substrato-inibitore-disaccoppiatore protocolli di titolazione, gli elettroni sono forniti a siti specifici della catena di trasporto degli elettroni, che consentono la valutazione della funzione mitocondriale. Tecniche di preparazione prima dell'analisi respirometrico della funzione mitocondriale, meccanici e chimici sono utilizzati per permeabilize il sarcolemma delle fibre muscolari. Permeabilizzazione chimica impiega saponina per perforare modo selettivo la membrana cellulare, pur mantenendo l'architettura cellulare.
Questo documento descrive accuratamente le fasi del processo di preparazione di fibre cardiache saponina di pelle per le misure di consumo di ossigeno per valutare OXPHOS mitocondriale. Inoltre, la risoluzione dei problemi indicazioni, nonché a specifici substrati, inibitori e uncouplers che possono essere utilizzati per determinare la funzione dei mitocondri in siti specifici della catena di trasporto degli elettroni sono forniti. È importante sottolineare che il protocollo descritto può essere facilmente applicata al tessuto cardiaco e scheletrico di vari modelli animali e campioni umani.
Protocol
Discussion
La saponina permeabilizzate tecnica fibra cardiaca offre un compromesso tra le uniche in vitro e in vivo, la valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale OXPHOS. I vantaggi di questa tecnica includono una maggiore rilevanza fisiologica rispetto ai mitocondri isolati come architettura cellulare è conservata. Mentre la membrana plasmatica è degradata, strutture a membrana intracellulari tra cui i mitocondri 12, 14, reticolo sarcoplasmatico 14, miofilamenti e il citoscheletro …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research e Genome Canada. JS detiene premi stipendio sostegno della Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada e la Canadian Diabetes Association. Il laboratorio vuole riconoscere l'assistenza tecnica di strumenti Oroboros durante l'acquisizione di saponina permeabilizzate tecnica di fibra.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
References
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