Summary
Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.
Abstract
Die breite Beteiligung von miRNAs in kritischen Prozesse der Gehirnentwicklung, Gewebe Homöostase und Krankheit hat zu einem steigenden Interesse bei den Forschungs-und Pharma-Gemeinden geführt. Zur Untersuchung miRNAs, ist es unerlässlich, dass die Quantifizierung von microRNA Ebenen präzise und robust ist. Durch den Vergleich Wildtyp zu kleinen RNA defizienten embryonalen Stammzellen der Maus (MESC), zeigte uns einen Mangel an Genauigkeit und Robustheit, die in früheren Multiplex qRT-PCR-Techniken. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren, einschließlich Reinigung entfernt übermäßige Primer aus früheren Multiplex Schritte vor Singleplex Echtzeit-Erkennung, die dramatisch erhöht die Genauigkeit und Robustheit der Technik. Darüber hinaus erklären wir, wie die Durchführung der Technik auf einem Mikrofluidik-Chip bei Nanoliterbereich reduziert Kosten für Reagenzien und ermöglicht Zeit effektiv mit hohem Durchsatz miRNA Expression Profiling.
Protocol
1. RNA-Extraktion: Zellen in Monolayer Grown
(Nach dem Protokoll des Herstellers mit TRIzol.)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # |
| TRIzol Lösung | Invitrogen | 15596-018 |
| Isopropylalkohol | Sigma-Aldrich | 1907-64 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Ethanol | ||
| RNAse freiem Wasser |
Homogenisierung
- Homogenisieren Zellen direkt auf der Kulturschale durch Zugabe von 1 ml Trizol-Lösung pro 10 cm 2 Schüssel Bereich, wirbeln die Trizol um und Pipette auf und ab, um eine vollständige Abdeckung der Platte zu gewährleisten.
Phasentrennung
- Inkubieren Sie die homogenisierte Probe für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Transfer in ein beschriftetes Röhrchen, 0,2 ml Chloroform pro 1ml TrizolSolution und schütteln Rohr von Hand kräftig 15 Sekunden lang.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Minuten.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 xg für 15 Minuten bei 2 ° C. Nach Zentrifugation der Mischung trennt sich in eine untere rote Phase, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase, die die RNA enthält, und sollte 60% der gesamten Trizol-Lösung Volumen.
RNA Niederschlag
- Die wäßrige, RNA enthaltende Phase in ein frisches, etikettiert Rohr.
- Fällung der RNA durch Zugabe von 0,5 ml Isopropylalkohol pro 1 ml Trizol Solution.
- Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Zentrifuge bei 12.000 xg für 10 Minuten bei 2 ° C.
RNA-wash
- Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen aus den Rohren.
- Waschen Sie die RNA-Pellet (auf der Seite und unten am Rohr) durch Zugabe von mindestens 1 ml 75% Ethanol pro 1 ml Trizol-Lösung, Vortex.
- Zentrifuge bei 7500 xg für 5 Minuten bei 2 ° C.
RNA Elution
- Überstand verwerfen und Zentrifuge wieder für 1 Minute. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
- Der Luft trocknen Pellet für 5-10 Minuten.
Hinweis: über getrocknete RNA ist schwer zu lösen. - Abgeblasen, und der Pellet in RNase freiem Wasser mit einer Pipette die Lösung auf-und abwärts und inkubieren für 10 Minuten bei 55 ° C.
- Measure-RNA-Konzentration (A260/280 Ratio) mit einem Nanodrop ™ Spektralphotometer.
- Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. RNA-Extraktion: Serum
(Nach Mirvana PARIS Kit Protokoll des Herstellers von Mitchell et al geändert. 1)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # | Kommentare |
| mir Vana PARIS Kit 2X Denaturierungslösung Acid-Phenol: Chloroform miRNA Wash Lösung 1 miRNA Waschlösung 2 / 3 | Ambion | AM1556 | Geändert Protokoll |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Ethanol | |||
| DEPC behandeltem Wasser |
Chemische Zubereitung:
- Add 375 ul 2-Mercaptoethanol für den 2X Denaturierungslösung und gut mischen.
- Fügen Sie 21 ml 100% Ethanol auf die miRNA waschen Lösung 1.
- 40 ml 100% Ethanol auf die miRNA Waschlösung 2 / 3.
Probenvorbereitung:
- Thaw Serumprobe auf Eis.
Homogenisierung
- Mix 300 ul Probe mit dem gleichen Volumen (300 ul) von 2X Denaturierungslösung (sollte bei Raumtemperatur) und Wirbel.
- Inkubieren Mischung auf Eis für 5 Minuten.
- Fügen Sie ein Volumen von Acid-Phenol: Chloroform gleich dem Gesamtvolumen der Probe Lysat plus 2X Denaturierungslösung (600 ul).
Wichtig: Verwenden Sie NICHT die wässrige Puffer, der auf der Oberseite des Säure-Phenol liegt: Chloroform. - Vortex-Gemisch für 60 Sekunden.
- Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (> 10.000 xg). Nach Zentrifugation der Mischung trennt sich in eine obere wässrige Phase, eine Interphase und eine untere organische Phase.
- Entfernen AqueOrganisationseinheiten Schicht auf der Oberseite (sollte 300 - 500 ul einschließlich proteinartigen "verschwommen" layer).
- Re-Extrakt wässrige Schicht nach wie vor durch erneute Zugabe Chloroform.
Wichtig: Die wässrige Schicht der zweiten Extraktion wird routinemäßig geringeres Volumen (250 ul). Beachten Sie die Lautstärke wieder.
Vorbereitung von Final RNA-Isolierung (Gesamt-RNA)
- Pre-Wärme (95 ° C) Nuklease-freies Wasser.
- 100% Ethanol muss bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden.
Finale RNA-Isolierung (Gesamt-RNA)
- Add 1,25 Volumen 100% Ethanol, um die wiederhergestellte wässrigen Phase (zB wenn 300 pl geborgen wurde, fügen Sie 375 ul Ethanol) und gründlich mischen.
- Für jede Probe statt einer Filterpatrone in einem der Sammelröhrchen.
- Pipette das Lysat auf den Filter.
- Zentrifuge (10.000 xg) für 30 Sekunden, entsorgen Sie die Flow-Through-, Zentrifugen wieder für 30 Sekunden, und ersetzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Sammel-Tube.
RNA-Wash
- Apply 700 ul miRNA Waschlösung 1, um die Filterpatrone und Zentrifuge für 15 Sekunden, entsorgen Sie die Flow-Through aus der Sammlung Rohr, und ersetzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Sammel-Tube.
- Apply 500 ul miRNA Waschlösung 2 / 3, Zentrifuge für 15 Sekunden, entsorgen Sie die Flow-Through und wiederholen Sie mit einer zweiten 500 ul Waschlösung 2 / 3.
- Verwerfen Sie den Durchfluss durch und trocken-Spin für 1-2 Minuten.
- Legen Sie Filterpatrone in einem frischen Sammelröhrchen, gelten 100 ul RNAse freies Wasser (95 ° C), in der Nähe Kappe und inkubieren für 2 Minuten.
- Zentrifuge für ca. 2 Minuten, um die RNA zu erholen.
- Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
3. Die Konzentration der RNA-Lösung (5fach)
(Nach der Herstellung des Protokolls)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # |
| MICROCON Zentrifugalfilter Devices, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC behandeltem Wasser |
Device: Microcon Ultracell YM-3, Cutoff SS und DS Nukleotide: 10
Volumen: Gewünschte Lautstärke wieder konzentrierter RNA-Lösung ist abhängig von experimentellen Design und kontrollieren sollte Experimente gehören.
- Legen Sie Microcon Probe Reservoir in einem Fläschchen und Pipette Lösung in den Behälter.
Hinweis: Berühren Sie nicht die Membran. - Zentrifuge für 185 Minuten bei 4 ° C mit maximal 14.000 x g.
Hinweis: Position Fläschchen mit Crack-Band in Richtung des Rotors. - Pipette gewünschte Volumen RNAse freies Wasser (z. B. 20 ul) auf den Tank, Ort Reservoir in ein neues Gefäß und Spin für 3 Minuten bei 4 ° C invertiert mit maximal 3000 x g.
- Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4. Reverse Transkription
(Nach einem Protokoll, das von Tang et al. 2 mit Änderungen.)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # | Kommentare |
| Hohe Kapazität cDNA-Archiv-Kit 10x cDNA Archivierung Buffer dNTP (100 mM) Moloney Maus-Leukämie-Virus (MMLV) Reverse-Transkriptase (50 U / ul) | Applied Biosystems | 4368814 | modifizierten Protokoll |
| RNaseOUT (40 U / ul) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-plex reverse Stem-Loop-Primer-Mix (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Brauch | Sequenzen * |
| DEPC behandeltem Wasser |
Reaction Volume: 5,5 ul
Hinweis: Die Endkonzentration des Stem-Loop-Primer sollte 1-5 nM (hier 2 nM) werden.
Bereiten Master-Mix (Volumes pro Reaktion) wie folgt:
| 1. DEPC-Wasser | 1,959 ul |
| 2. 10x RT-Puffer | 0,55 ul |
| 3. RNase Inhibitor (40 U / ul) | 0,0715 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 0,275 ul |
| 5. x-plex reverse Stem-Loop-Primer-Mix (40 nM) * | 0,275 ul |
| 6. MMLV-RT (50 U / ul) | 0,369 ul |
- Mix und kurz zentrifugieren.
- Add 3,5 ul Master-Mix auf 2 ul Probe.
- Führen Sie die folgenden RT-Reaktion:
16 ° C für 30 Minuten, gefolgt von 60 Zyklen bei 20 ° C gefolgt von 30 Sekunden, 42 ° C für 30 Sekunden, 50 ° C für ca. 1 Sekunde und schließlich 85 ° C für 5 Minuten auf MMLV-RT, 4 ° C inaktivieren ∞ . - Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.
* Liste der Reverse Stem-Loop-Primer sind zu finden unter http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Pre-Amplification (Pre-PCR)
(Nach einem Protokoll, das von Tang et al. 2 mit Änderungen.)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # | Kommentare |
| dNTP (100 mM) | Applied Biosystems | 4368814 | Hohe Kappe. cDNA-Archiv Kit. |
| 2x Universal PCR Master Mix mit NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-plex Vorwärtsprimer Mix (450 nm) * | Integrated DNA Technologies | Brauch | Sequenzen * |
| Universal-Reverse-Primer (100 uM) | Integrated DNA Technologies | Brauch | Sequence 2 |
| AmpliTaqGold Polymerase (5 U / ul) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC behandeltem Wasser |
Reaction Volume: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-Produkt)
Hinweis: Pre-Verstärkung ist notwendig, um die Signalstärke zu verbessern, besonders am Anfang Konzentration der RNA begrenzt ist. Die Eingabe RNA-Ebene bestimmt die optimale Anzahl von Pre-PCR-Zyklen. Angesichts der gleichen relativen Effizienz jedem PCR-Zyklus sollte die doppelte Konzentration des Endproduktes. Da einige miRNAs werden mehr hoch exprimiert, über Radfahren zu vermeiden. Allerdings können unter-Amplifikation in einem Verlust von Nachweisempfindlichkeit Ergebnis, vor allem für microRNAs auf niedrigem Niveau exprimiert. In unseren Händen 12 voreingestellte Amplifikationszyklen mit 100 ng Gesamt-RNA, zu genügen schien. Mit Serum als Ausgangsmaterial, 12 Zyklen Ergebnisse in nachweisbaren miRNA Ebenen, aber 15 Zyklen erschienen überlegen zu sein. Schließlich beginnend mit 3 Oozyten (ca. 400 pg Gesamt-RNA pro Oocyte 3), 16 Vorverstärkung Zyklen erfolgreich konnten wir zum Screening auf microRNA Expression Level 4.
* Liste der Forward-Primer sind zu finden unter http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Bereiten Master-Mix (Volumes pro Reaktion) wie folgt:
| 1. 2x Universal-MM | 13,75 ul |
| 2. DEPC-Wasser | 0,792 ul |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0,55 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 1,1 ul |
| 5. x-plex Vorwärtsprimer Mix (450 nM) | 3,06 ul |
| 6. Universal-RP (100 uM) | 1,375 ul |
| 7. AmpliTaqGold Polymerase (5 U / ul) | 1,375 ul |
- Mix und kurz zentrifugieren.
- Add 22 ul Master-Mix, um jeweils 5,5 ul RT-Produkt.
- Führen Sie die folgenden Pre-PCR-Reaktion:
95 ° C für 10 min, 55 ° C für 2 min, gefolgt von 10 bis 18 Zyklen von 95 ° C für 1 s und 65 ° C für 1 min, 4 ° C ∞.
6. Die Reinigung des Pre-PCR-Produkt
Reinigung durch Größenauswahl auf einem 10% nativen Polyacrylamidgel
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # |
| 40% Acrylamid / Bis-Lösung | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp DNA-Leiter | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Gold-Nukleinsäure-Gel-Fleck 10.000 x Konzentrat in DMSO | Invitrogen | S11494 |
| Glykogen (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Buffer-EB | ||
| 10% Ammoniumpersulfat (APS) | ||
| TEN-Puffer | ||
| 6x Orange G | ||
| DEPC behandeltem Wasser | ||
| ddH2O |
a. Gel Vorbereitung
Um 10ml einer 10% igen Polyacrylamid-Mischung hinzufügen zu machen
| 1. ddH 2 O | 6,5 ml |
| 2. 10x TBE | 1 ml |
| 3. Polyacrylamid (40%) | 2,5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 ul |
| 5. TEMED | 4 ul |
- Bereiten DNA-Leiter:
- 0,5 ul 10 bp DNA-Leiter
- 4,5 ul Puffer (EB)
- 1 ul 6x Orange G
- Add 5,5 ul 6x Orange G zu jeder 27,5 ul Pre-PCR-Produkt.
b. Run Gel
- Run Gel mit 150V für 55-60 Minuten.
Hinweis: Bromphenolblau als Indikator läuft mit 20bp Region.
c. Stain Gel
- Stain Gel mit SYBR-Gold für 25 Minuten am Schüttler.
Hinweis: SYBR-Gold ist lichtempfindlich.
d. Cut Gel
- Schneiden Sie Pre-PCR-Produkt-Band von 60 bis 80 bp und Transfer zum markierten Röhre.
Hinweis: Ein Band für geringe RNA-Eingang Pre-PCR-Produkte möglicherweise nicht sichtbar. - Crush-Gel-Band (z. B. Rohr im Rohr Zentrifugation).
e. Re-Extrakt cDNA
- Geben Sie 300 ul TEN-Puffer und Inkubation bei 37 ° C für 4 Stunden auf einem Rotator.
- Wärmeträgerflüssigkeit in einen gekennzeichneten Sammelröhrchen, fügen Sie weitere 300 ul TEN-Puffer auf das Gel-haltigen Röhrchen und inkubieren alle bei 4 ° C über Nacht auf einem Rotator.
- Absaugen restliche Flüssigkeit, um die markierten Sammelröhrchen als vor der Übertragung und beachten Sie die insgesamt erholt Volumen.
f. Ethanolfällung
- Add 3 Bände Raumtemperatur 100% Ethanol.
- Add 0,5 ul Glycogen (20 mg / ml).
- Vortex.
- Inkubieren auf Trockeneis für mindestens 2 Stunden oder bei -80 ° C über Nacht.
- Spin in Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 30 Minuten auf Pellet-cDNA.
- Dump Flüssigkeit, fügen Sie 700 ul Raumtemperatur 75% Ethanol und Spin für 10 Minuten.
- Dump Flüssigkeit und drehen Sie erneut für 5 Minuten.
- Abzusaugen Überstand ohne störende Pellet an der Luft trocknen für 10 Minuten.
- Abgeblasen, und der Pellet in sauberem Wasser.
Hinweis: Gewünschte Volumen konzentrierter cDNA-Lösung ist abhängig von experimentellen Design und kontrollieren sollte Experimente gehören.
7. Die Reinigung des Pre-PCR-Produkt
Reinigung durch enzymatische Verdauung der Primer gefolgt von Spin-Säule (in Anlehnung an die Hersteller-Protokolle)
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 |
Hinweis: In unseren Händen die exklusive enzymatische clean-up erfolgreich entfernt Primer, sondern auch zu einer teilweisen Abbau des vorverstärkt Produkt geführt, möglicherweise aufgrund einer teilweisen Denaturierung der Short-Produkten wie Temperatur bis steigt auf 80 ° C während der Inaktivierung Schritt der Enzym. Vermeiden Sie Hitze-Inaktivierung und direkt die Reinigung der PCR-Produkte aus der enzymatischen Reaktion mittels Spin-Säulen entfernt alle Primer ohne Produkt Abbau.
- Mix 5 ul post-PCR-Produkt mit 2 ul ExoSAP-IT.
- Bei 37 ° C für 15 Minuten, um die verbleibenden Primer und Nukleotide abgebaut werden.
- Add 5 Volumen Puffer PB zu 1 Volumen der PCR-Reaktion und mischen, wenn pH-Indikator I hinzugefügt wurde, um PB Buffer, ob die Farbe der Mischung gelb ist.
- Legen Sie eine MinElute Spalte in einer dafür vorgesehenen 2 ml Sammel-Tube in ein geeignetes Rack.
- Übernehmen Sie die Probe auf die Säule und MinElute Zentrifuge für 1 Minute.
- Durchfluss verwerfen, statt der MinElute Spalte wieder in das gleiche Rohr und fügen 750 ul Puffer PE auf die MinElute Spalte zu waschen und für 1 Minute zentrifugiert.
- Durchfluss verwerfen und statt der MinElute Spalte wieder in das gleiche Rohr. Zentrifugieren Sie die Spalte für 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit.
- Legen Sie die MinElute Spalte in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß.
- Zum Eluieren der DNA, mit 10 ul DEPC behandeltes Wasser in die Mitte der Membran, lassen Sie die Spalte für 1 Minute stehen und dann CENrifuge für 1 Minute.
8. Fludigim 96,96 qRT-PCR Profiling
| Name des Reagenzes | Firma | Prod / Cat # | Kommentare |
| Fluidigm 96,96 Dynamic Array Kit 96,96 dynamischen Arrays 96,96 Steuerleitung Flüssigkeit 20x Loading Reagent | Fluidigm Corporation | ||
| Mix von Universal-Reverse-Primer (1 pM) Vorwärts-Primer (1 pM) TaqMan-Sonde (0,2 uM) | Integrated DNA Technologies | Brauch | Sequence (1) |
| 2x Universal PCR Master Mix mit NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Priming der 96,96 Dynamic Array IFC
- Inject Steuerleitung Flüssigkeit (150 ul) in jede der Akkumulatoren auf dem Chip.
- Legen Chip in die IFC (Integrated Fluidic Circuit)-Controller, und führen Sie die Prime (136x) Skript zur prime Steuerleitung Flüssigkeit in den Chip.
Hinweis: Chip muss verwendet werden 24 Stunden nach dem Öffnen der Verpackung sein. Vergewissern Sie sich nicht an die Steuerleitung Flüssigkeit verschüttet seit Steuerleitung Flüssigkeit auf dem Chip oder in den Einlässen macht den Chip unbrauchbar machen. Chip muss innerhalb von 60 Minuten Grundierung geladen werden.
2. Vorbereitung der Proben
2.1 Vor-Probenvorbereitung
In einem Einweg-Kunststoff-Rohr, kombinieren die Komponenten in der Tabelle unten, um die Sample-Pre-Mix (Volumes pro Eintritt) zu machen.
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2,5 ul |
| 20x Loading Reagent | 0,25 ul |
Hinweis: Endgültiges Volumen beträgt 2,75 ul, wie overage für Pipette Verluste verzichten
2.2 Probenvorbereitung-Vorbereitung
Kombinieren Sie in 96-Well-Format jede Probe mit Pre-Sample-Mix (Volumes pro Eintritt).
| Pre-Sample-Mix | 2,75 ul |
| Probe | 2,25 ul |
Hinweis: Vortex und Zentrifuge 96-Well-Platte kurz Flüssigkeit zu sammeln.
Endgültiges Volumen pro Einlass 5 ul nehmen Pipettieren Verlust Berücksichtigung durch die Vorbereitung etwas höhere Lautstärke.
2.3 Vorbereitung der 13x Assays
- Verwenden Sie eine 96-Well-Platte 13x Tests vorzubereiten. 1x Konzentrationen in der Tabelle unten, Scale-up für 13x.
| Universal-Reverse-Primer | 1 um (1x) | Sequence in 2 |
| Vorwärts Primer * | 1 um (1x) | * |
| Gen-spezifische TaqMan Probe # | 0,2 mu m | # |
* Liste der Forward-Primer sind zu finden unter http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
# Liste der TaqMan-Sonden sind zu finden unter http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- Kombinieren Sie in eine neue 96-Well-Platte Aliquots der 13x-Assays mit Tween für eine 0,25% Tween endgültige Konzentration
Hinweis: Endgültiges Volumen pro Einlass ist 5 ul, bereiten ausreichendes Volumen (5,5 ul), um den Verlust während der Lautstärke übertragen berücksichtigen. - Gut mischen, blasenfrei und kurz zentrifugieren, um Flüssigkeit zu sammeln.
3. Lädt den Chip
Hinweis: Um für die richtige Beladung von Proben und Assays sorgen für die richtige Positionierung des Chips zu ermöglichen. Es ist zweckmäßig, die Kerbe an der oberen linken Ecke ausrichten.
Sicherstellen, dass alle Tests und Musterlösungen sind vor dem Laden des Chip gemischt. Es ist zweckmäßig, diese in einer 96-Well-Platte zu tun und drehen Sie die Platte nach unten vor dem Einlegen des Chips. Seien Sie sich bewusst von der Chip-Karte Pipettieren zum späteren Nachschlagen.
Ungenutzte Probeneinlässe sollte mit 2,75 ul Probe Mix und 2,25 ul DNA freies Wasser gefüllt werden.
Ungenutzte Assay Einlässe sollten mit 2,5 ul Assay loading Reagenz und 2,5 ul Wasser gefüllt werden.
Gehen Sie nicht vorbei an der ersten Haltestelle beim Pipettieren zu vermeiden Einführung von Luftblasen.
- Nach dem Laden der Proben und Assays (Volumen pro Eingang: 5 ul) laufen die Load-Mix-Skript (136x) Skript, um die Proben und Assays in den Chip zu laden.
- Nachdem das Skript fertig ist, entfernen Sie den Chip von der ICF-Controller.
- Ziehen Sie die blaue Schutzfolie von der Unterseite des geladenen Chip.
- Entfernen Sie alle Staubpartikel oder Schmutz von der Chip-Oberfläche.
4. 96,96 qRT-PCR
- Übertragen Sie die Chips auf die BioMark-System und verwenden Sie die folgende Verstärkung Bedingungen:
55 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 55 ° C für 1 min folgte. - Folgen Sie Herstellers Protokoll für Datenerfassung-Software.
5. Mit dem qPCR-Analyse-Software
Nach RT-PCR die proprietäre Software bietet Amplifikationskurven, Heat Maps und Ct-Werte für jeden gut. Bitte beachten Sie die Software-Handbuch für die Datenanalyse.
9. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Workflow. Dargestellt ist eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Multiplex-qRT-PCR-Protokoll, einschließlich der Reinigung (Schritt E) des übermäßigen Primer von Multiplex reversen Transkription (Schritt C) und Multiplex-Vorverstärkung (Schritt D) vor Echtzeit-Erkennung (Schritt F), was zu einem gereinigten cDNA-Vorlage für qRT-PCR. FP: microRNA spezifischen Vorwärts-Primer, URP: universal Reverse-Primer, R-SLP: microRNA spezifische reverse Stem-Loop-Primer.
Klicken Sie hier für ein größeres Bild.
Abbildung 2. . Polyacrylamid-Gel Reinigung der qRT-PCR-Template nach Prä-PCR-Bands der Prä-PCR-Produkt Größe werden ausschließlich in WT-Proben gesehen, aber nicht in microRNA mangelhaft DGCR8 - / - oder Dicer - / - Proben (Pfeile) nach 96-plex RT und 12 Zyklen der Vorverstärkung. Beachten Sie, dass nicht-spezifische Produkte unbekannter Herkunft (Pfeilspitzen) und übermäßige Primer in allen Proben (Sterne) zu finden sind.
Abbildung 3. Reinigung nach dem Multiplex-Vorverstärkung wesentlich verbessert die Genauigkeit der qRT-PCR-Ergebnisse a) Vergleich der relativen Expression von WT MESC zu DGCR8 -. / - (Kanonische microRNA mangelhaft) MESC zeigt 1) den Nachweis von mehr microRNAs und 2) den Verlust von falsch-positiven Signale in DGCR8 - / - Hintergründe nach der Reinigung entfernt Primer der Prä-PCR-Produkt. b) Nach der Reinigung, relative Expression der beiden DGCR8 - / - / WT und Dicer - / - / WT zeigen einen Verlust von falsch-positiven Signale und damit für die richtige Einordnung der seltenen DGCR8 unabhängige / Dicer abhängig kleinen RNAs (miR-320, - 484, -877). 5
Abbildung 4. Fluidigm High-Throughput-qRT-PCR miRNA Profiling. Beispiel Bildschirm 96,96 Fluidigm qRT-PCR mircoRNA Profiling Screenshot für Veränderung in miRNA Ebenen von Prostatakrebs Patientenseren. Die real-time qPCR-Analyse-Software bietet Amplifikationskurven, farbkodierte Heat Maps und cycle threshold (CT).
Discussion
miRNAs sind kurze (18-24 Nukleotide), nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression post-transkriptionell reguliert sowohl destabilisierende Boten-RNAs (mRNA) und hemmt deren Übersetzung. 6 Die Tatsache, dass mindestens ein Drittel der menschlichen Gene enthalten konservierte miRNA binding-sites in ihrer 3'UTR und die offenkundige Wechselwirkungen von miRNAs mit Genen für Pluripotenz, Proliferation und Apoptose schlägt einen entscheidenden Beitrag in Zellschicksal Entscheidungen Gewebshomöostase und Krankheiten wie Krebs. 6,7 Deshalb genaue microRNA Expression Profile sind breiter Interesse.
Um zu testen, die veröffentlichten Multiplex qRT-PCR miRNA Expression Profiling Protokoll 2 verwendeten wir kleine RNA-defizienten MESC als negative Kontrollen. DGCR8 - / - Zellen sind mangelhaft aller kanonischen microRNAs, während Dicer - / -. Zellen sowohl kanonischen und nicht-canoncial micoRNAs mangelnde 8,9
Vergleicht man Ebenen in Wildtyp-MES-bis DGCR8 - / - Zellen, entdeckten wir einen Mangel an Genauigkeit, da mehrere ausgedrückt 10 microRNAs nicht in den Wildtyp-Zellen 11 erkannt. Einige zeigten sogar niedriger Expression relativ zu den Knockout-Zellen (Abbildung 3a). Wir vermuten, dass der Mangel an Genauigkeit durch die massive Grundierung Übertrag der beiden aufeinanderfolgenden Schritte Multiplex (RT und Pre-PCR) vor Singleplex RT-Quantifizierung verursacht werden könnte. Allerdings ist Multiplex Vorverstärkung notwendig, um die Signalstärke zu verbessern, besonders am Anfang Konzentration der RNA begrenzt ist. / - - Durch Reinigung entfernt pre-PCR-Produkte von Primern nach Größe Auswahl an nativen Polyacrylamidgelen (Abbildung 2), konnten wir eine deutliche Verbesserung der Genauigkeit durch die Erkennung mehr microRNAs und einen Verlust von falsch-positiven Signale in beide DGCR8 demonstrieren und Dicer - / - Hintergründe (Abbildungen 3a und 3b) Neben der modifizierten qRT-PCR-Ansatz für die ordnungsgemäße Zuordnung von seltenen DGCR8 unabhängige / Dicer abhängig kleinen RNAs (Abbildung 3b) 11 erlaubt. Deshalb ist ein zusätzlicher Schritt, um übermäßige Primer vom Prä-PCR-Produkt zu reinigen ist eindeutig von Vorteil, vor allem, wenn große Multiplex-Primer-Sets pro Probe.
Die optimale Anzahl der Vor-Amplifikationszyklen wird durch die Eingabe RNA-Konzentrationen bestimmt. Der Restbetrag nicht unter-oder overamplify sollte durch die Angabe der spezifischen Experiment geführt werden.
Mit mehr als tausend bekannten microRNAs, von Standard-Einsatz 384-well Platten möglicherweise nicht optimal für ausgedehnte microRNA Profiling, insbesondere beim Vergleich mehrerer Proben. Die Fluidigm Dynamic Array IFC ermöglicht, mit einer signifikanten Abnahme der Pipettierschritte und brauchte Chemie-, Prüf-bis zu 96 einzelnen Proben gegen 96 verschiedene Mikro-RNAs in einem einzigen Experiment (9216 Reaktionen) bei Nanoliter-Maßstab (6,7 nL). Für jeden Lauf der Analyse-Software bietet Amplifikationskurven, farbkodierte Heat Maps und radeln Schwellenwerten (CT). Die gleichzeitige großen Profilierung reduziert experimentellen Abweichungen und ermöglicht bedeuten Ausdruck Normalisierung, die aus-führt andere Normalisierung Strategien, die Verwendung von kleinen RNA Kontrollen machen. 12
Im Vergleich zu handelsüblichen 384-Well-Plattformen mit vorbelegt TaqMan-Sonden, bietet die Kombination aus einem High-Throughput-Profiling-Plattform mit maßgeschneiderten Primer setzt hohe experimentelle Flexibilität.
Die optimierte Multiplex qRT-PCR-Ansatz in Kombination mit der Dynamic Array-Plattform erfolgreich konnten wir gleichzeitig Bildschirm 48 Prostatakrebs Patientenseren auf Veränderungen in Stufen von 384 miRNA (Abbildung 4) und die Daten ohne Dorn in der Kontrollgruppe (dh synthetische microRNAs) zu normalisieren. 11
Trotz der Zunahme der Schritte von Proben der Vorbereitung bis zur Profilierung ergibt, ist das beschriebene Vorgehen eine zeit-und kostengünstig mit hohem Durchsatz Methode, um große Sample-Sets für miRNA Expression Profil, auch mit begrenzten Ausgangsmaterial.
Disclosures
Alan Mir ist ein Mitarbeiter von Fluidigm Corporation. Ansonsten haben wir keine finanziellen Interessen offen zu legen.
Acknowledgments
Wir möchten die Blelloch Labor zur Kommentierung des Textes danken. Diese Arbeit wurde vom Fonds zur RB von NIH (K08 NS48118 und R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Seed Grants RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) und dem Pew Charitable Trust und FM aus den unterstützten Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
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