Summary
Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.
Abstract
MiRNA'lar, gelişme, doku homoeostasis ve hastalığın altında yatan kritik süreçlerin geniş katılımı, araştırma ve ilaç topluluklar arasında kabaran ilgi açmıştır. MiRNA'lar çalışma için, microRNA düzeylerinin ölçülmesi, doğru ve sağlam olması gereklidir. Küçük RNA eksik fare embriyonik kök hücreleri (Mesc) yabani tip karşılaştırarak, biz daha önce yayınlanmış multipleks QRT-PCR teknikleri doğruluk ve sağlamlık eksikliği saptandı. Burada, tekniğin doğruluk ve sağlamlık önemli ölçüde artırır singleplex gerçek zamanlı algılama, önce önceki multipleks adımları aşırı primerler uzak arıtma da dahil olmak üzere optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, mikroakışkan nanoliter hacimlerinde bir çip üzerinde tekniği performans nasıl biz açıklamak reaktif maliyetlerini önemli ölçüde azaltır ve zaman etkili yüksek kapasiteli miRNA ifade profil izin verir.
Protocol
1. RNA Ekstraksiyon: Hücreler Monolayer de Yetiştirilen
(TRIzol kullanarak üreticinin protokol.)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # |
| TRIzol Çözüm | Invitrogen | 15596-018 |
| Izopropil alkol | Sigma-Aldrich | 1907-1964 |
| Kloroform | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Etanol | ||
| RNAse ücretsiz su |
Homojenizasyon
- Trizol etrafında girdap, 10 cm 2 çanak alan başına 1 ml Trizol Çözüm ekleyerek doğrudan kültür tabağına hücreleri homojenize ve plakası tam kapsama sağlamak için pipet ve aşağı yukarı.
Faz Ayırma
- Homojenize örnek oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Etiketli bir tüp içine aktarın, 1ml TrizolSolution başına 0.2 ml kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca el ile tüp kuvvetlice sallayın.
- 3 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 12.000 xg'de örnek Santrifüj az 15 dakika boyunca 2 ° C Santrifüj sonra karışımı daha düşük bir kırmızı faz, bir interfaz ve RNA içeren renksiz bir üst sulu faz ayrılır ve toplam Trizol Çözüm hacmi% 60 olmalıdır.
RNA Yağış
- RNA taze, etiketli tüpe faz içeren sulu aktarın.
- Trizol Çözüm 1 ml başına 0.5 ml izopropil alkol ekleyerek RNA çöktürün.
- Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 12.000 xg'de santrifüjleyin 2 ° C
RNA yıkama
- Santrifüj sonrasında tüplerin süpernatant atın.
- % 75 etanol Trizol Çözüm, girdap 1 ml başına en az 1 ml ekleyerek RNA pelet (tüp Yan ve alt) yıkayın.
- 5 dakika 7500 xg'de santrifüjleyin 2 ° C
RNA Elüsyon
- Süpernatantı atın ve 1 dakika için tekrar santrifüj. Aşırı sıvı çıkarın.
- Hava-kuru pelet 5-10 dakika.
Not: Kurutulmuş RNA üzerinde zor çözünür. - RNaz ücretsiz su pelet çözüm yukarı ve aşağı pipetleme tarafından çözülür ve 10 dakika boyunca inkübe 55 ° C
- Nanodrop ™ spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu (A260/280 oranı) ölçün.
- Kullanılmak üzere -80 ° C ye kadar hazır saklayınız.
2. RNA Ekstraksiyon: Serum
(Ardından Mirvana PARIS Kit üretici protokolü Mitchell ve arkadaşları tarafından modifiye 1)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # | Yorumlar |
| mir Vana PARIS Kiti 2X denatüre Çözüm Asit-Fenol: Kloroform miRNA Yıkama Çözüm 1 miRNA Yıkama Çözeltisi 2 / 3 | Ambion | AM1556 | Modifiye protokolü |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Etanol | |||
| DEPC Su tedavi |
Kimyasal Hazırlanışı:
- 2-merkaptoetanol 375 ul 2X denatüre Çözüm ekleyin ve iyice karıştırın.
- Çözüm 1 miRNA yıkama için 21 ml% 100 etanol ekleyin.
- MiRNA yıkama Çözüm 2 / 3, 40 ml% 100 etanol ekleyin.
Numune Hazırlama:
- Buz üzerinde serum örnek çözülme.
Homojenizasyon
- 2X denatüre Çözüm eşit hacimli (300 ul) (oda sıcaklığında olmalı) ve vorteks ile 300 ul örnek karıştırın.
- 5 dakika buz karışımı inkübe edin.
- Asit-Fenol hacmi ekleyin: örnek lizat artı 2X denatüre Çözüm (600 ul) toplam hacmine eşit Kloroform.
Önemli: Kloroform: Asit-Fenol üstünde yer alan sulu tampon kullanmayın. - Vorteks karışımı 60 saniye boyunca.
- Maksimum hız (> 10.000 xg) 15 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. Santrifüj sonra karışımı bir üst sulu faz, interfaz ve daha düşük bir organik faz ayrılır.
- Aque çıkarınlı üst katmanı (300 olması gerekir herhangi bir proteinacious "puslu" katmanı da dahil olmak üzere 500 ul).
- Re-ayıklamak kloroform tekrar ekleyerek daha önce olduğu gibi sulu tabaka.
Önemli: ikinci ekstraksiyon sulu tabaka (250 ul) hacim olarak rutin küçük. Ses iyileşti Not.
Final RNA İzolasyon (toplam RNA) hazırlanması
- Ön ısıtma (95 ° C) nükleaz içermeyen su.
- % 100 Etanol, oda sıcaklığında olmalıdır.
Final RNA İzolasyon (toplam RNA)
- Kurtarılan sulu faz (örneğin 300 ul kurtarıldı, 375 ul etanol)% 100 etanol 1.25 birimleri ekleyin ve iyice karıştırın.
- Her bir örnek için, filtre kartuşu toplama tüpleri birine yerleştirin.
- Filtre üzerine lizat Pipet.
- Santrifüj (10.000 xg) 30 saniye boyunca, akış yoluyla atmak için tekrar 30 saniye santrifüj ve aynı toplama tüpünün içine filtre kartuşunu değiştirin.
RNA Yıkama
- 700 ul miRNA Yıkama Çözüm 1 uygulayın, 15 saniye için filtre kartuşu ve santrifüj toplama tüpünden akış üzerinden atmak ve aynı toplama tüpünün içine filtre kartuşunu değiştirin.
- Flow-through atmak ve tekrar ikinci bir 500 ul Yıkama Çözeltisi 2 / 3 ile 15 saniye, 500 ul miRNA Yıkama Çözeltisi 2 / 3, santrifüj uygulayın.
- 1-2 dakika akış ve kuru-spin atın.
- Yeni bir toplama tüpüne koyun filtre kartuşu, 100 ul RNAse ücretsiz su (95 ° C), yakın kapak ve 2 dakika boyunca inkübe geçerlidir.
- ~ 2 dakika RNA kurtarmak için santrifüjleyin.
- Mağaza -80 ° C kullanana kadar.
3. RNA Çözüm Konsantrasyon (5X)
(Üretimi protokol)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # |
| MICROCON Santrifüj Filtre Cihazlar, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC Su tedavi |
Aygıt: Microcon Ultracell YM-3, Kesim SS ve DS Nükleotidler: 10
Cilt: İstenen hacmi yeniden konsantre RNA çözüm, deneysel tasarım bağımlı ve kontrol deneyleri içermelidir .
- Microcon örnek rezervuar rezervuar içine şişe ve pipet çözüm içine yerleştirin.
Not: membran dokunmayın. - 185 dakika santrifüj 4 ° C maksimum 14.000 x g.
Not: Rotor doğru çatlak bandı ile pozisyon flakon. - 4 3 dakika için yeni şişe ve spin RNAse serbest su rezervuar üzerine Pipet istenilen hacmi (örneğin 20 ul), yer rezervuar içine ters ° C maksimum 3000 x g.
- Mağaza -80 ° C kullanana kadar.
4. Ters Transkripsiyon
(Değişiklikler ile Tang ve arkadaşları tarafından bir protokol. 2.)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # | Yorumlar |
| Yüksek kapasiteli cDNA arşiv kiti 10x cDNA arşivleme Tampon dNTP (100 mM) Moloney fare lösemi virüsü (MMLV) transkriptaz (50 U / ml) ters | Applied Biosystems | 4368814 | modifiye protokol |
| RNaseOUT (40 U / ml) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-plex ters kök döngü astar karışımı (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Özel | Dizileri * |
| DEPC Su tedavi |
Reaksiyon Cilt: 5.5 ul
Not: kök döngü primerler nihai konsantrasyonu 1-5 nM (burada 2 nM) olmalıdır.
Master-Mix (tepki ortalama Birimleri) aşağıdaki gibi hazırlayın:
| 1. DEPC-Su | 1.959 ul |
| 2. RT-Tampon 10x | 0.55 ul |
| 3. RNaz İnhibitör (40 U / ml) | 0,0715 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 0.275 ul |
| 5. x-plex ters kök döngü astar karışımı (40 nM) * | 0.275 ul |
| 6. MMLV RT (50 U / ml) | 0,369 ul |
- Mix ve santrifüj kısaca.
- 2 ul örnek Master Mix 3.5 ul ekleyin.
- Aşağıdaki RT-tepki gerçekleştirin:
20 60 çevrimleri ile 30 dakika süreyle 16 ° C, ° C 30 saniye, 42 ° C, 30 saniye boyunca 50 ° C için 1, ikinci ve son olarak 85 ° C, MMLV-RT, 4 inaktive 5 dakika boyunca ° C ∞ . - Kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
* Ters kök döngü primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Ön Amplifikasyon (Pre-PCR)
(Değişiklikler ile Tang ve arkadaşları tarafından bir protokol. 2.)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # | Yorumlar |
| dNTP (100 mM) | Applied Biosystems | 4368814 | Yüksek kap. cDNA arşiv Kiti. |
| NoAmpErase UNG 2x Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-plex ileri astar karışımı (450 nM) * | Integrated DNA Technologies | Özel | Dizileri * |
| Evrensel Ters Astar (100 mcM) | Integrated DNA Technologies | Özel | Sıra 2 |
| AmpliTaqGold polimeraz (5 U / ml) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC Su tedavi |
Reaksiyon Cilt: 27.5μl (22μl AA + 5.5μl RT-Ürün)
Not: Ön Amplifikasyon RNA başlangıç konsantrasyonu özellikle sınırlı, sinyal gücünü artırmak için gerekli. Giriş RNA seviyesi Pre-PCR döngüleri optimal sayısını belirler. Aynı göreceli verimlilik göz önüne alındığında her PCR döngüsü nihai ürünün konsantrasyonu iki katına çıkacaktır. Bazı miRNA'lar daha yüksek ifade olacağından, bisiklet üzerinde kaçının. Ancak, özellikle düşük seviyelerde ifade microRNA amplifikasyon altında, algılama hassasiyet kaybına neden olabilir. Toplam RNA 100ng kullanarak 12 öncesi amplifikasyon döngüsü, elimizde yeterli çıktı. Başlangıç materyali, saptanabilir miRNA düzeyleri 12 kür, ancak üstün olduğu ortaya çıktı 15 döngü olarak serum kullanma. Son olarak, 3 oosit (oosit 3 başına yaklaşık 400 pg toplam RNA), 16 preamplifikatörde döngüsü ile başlayan başarıyla microRNA ekspresyon düzeyleri 4 için ekran için bize izin verdi.
* Ileri primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Master-Mix (tepki ortalama Birimleri) aşağıdaki gibi hazırlayın:
| 1. 2x Evrensel AA | 13.75 ul |
| 2. DEPC-Su | 0,792 ul |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0.55 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 1.1 ul |
| 5. x-plex ileri astar karışımı (450 nM) | 3.06 ul |
| 6. Evrensel RP (100 mcM) | Ul 1,375 |
| 7. AmpliTaqGold polimeraz (5 U / ml) | Ul 1,375 |
- Mix ve kısaca santrifüj.
- Her 5.5 ul RT-Ürün 22 ul Master-Mix ekleyin.
- Aşağıdaki Pre-PCR gerçekleştirin:
10 dakika süreyle 95 ° C, 55 ° C 'de 2 dakika süreyle, 10 - 1 ve 65 - 95 ° C 18 kür ° C 1 dakika boyunca, 4 ° C ∞.
6. Pre-PCR Ürün saflaştırılması
% 10 yerli poliakrilamid jel boyutu seçimi Arıtma
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # |
| % 40 Akrilamid / Bis Çözüm | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp DNA merdiveni | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Altın nükleik asit jel leke DMSO 10.000 X konsantre | Invitrogen | S11494 |
| Glikojen (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Tampon-EB | ||
| % 10 Ammoniumpersulfate (APS) | ||
| TEN-Buffer | ||
| 6x Turuncu G | ||
| DEPC Su tedavi | ||
| ddH2O |
a. Jel Hazırlık
10ml% 10 poliakrilamid karışımı ekleyin yapmak için
| 1. GKD 2 O | 6,5 ml |
| 2. 10x TBE | 1 ml |
| 3. Poliakrilamid (% 40) | 2.5 ml |
| 4. APS (% 10) | 80 ul |
| 5. TEMED | 4 ul |
- DNA merdiven hazırlayın:
- 0.5 ul 10 bp DNA merdiveni
- 4.5 ul Tampon (EB)
- 1 ul 6x Turuncu G
- Her 27.5 ul Pre-PCR ürününün 5.5 ul 6x Turuncu G ekleyin.
b. Jel çalıştırın
- 55-60 dakika için 150V ile Jel çalıştırın.
Not: göstergesi olarak Bromofenol mavi 20bp bölge ile çalışır.
c. Jel Leke
- Çalkalayıcı üzerinde 25 dakika süreyle SYBR-Gold ile jel Leke.
Not: SYBR-Gold ışığa karşı hassastır.
d. Jel Kes
- 60-80 bp Pre-PCR ürün grubu kesin ve etiketli tüp transferi.
Not: düşük RNA giriş Pre-PCR ürünleri için bir bant görünür olmayabilir. - Jel bandı (örneğin tüp santrifüj tüp) Crush.
e. Re-Özü cDNA
- 300 ul ekle TEN az 37-Tampon ve inkübe ° C 4 saat rotator.
- Etiketli bir toplama tüpüne transfer sıvı jel içeren tüp, 300 ul TEN-Buffer ekleyin ve tüm inkübe 4 ° C rotator geceleme.
- Kalan sıvı aspire etiketli toplama tüpü, daha önce olduğu gibi aktarmak ve toplam kurtarılan hacmi not edin.
f. Etanol Yağış
- Oda sıcaklığında% 100 etanol 3 cilt ekleyin.
- 0.5 ul Glikojen (20 mg / ml) ekleyin.
- Vorteks.
- Kuru buz üzerinde en az 2 saat veya -80 ° C gece inkübe edin.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca pelet cDNA mikrosantrifüj içinde dönmeye.
- Sıvı dökümü, 700 ul oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 75 etanol ve spin ekleyin.
- Sıvı dökümü ve 5 dakika için tekrar döndürün.
- 10 dakika boyunca pelet ve kuru hava bozmadan süpernatant emmek.
- Temiz su pelet çözülür.
Not: İstenen hacim konsantre cDNA Çözüm, deneysel tasarım bağımlı ve kontrol deneyleri içermelidir .
7. Pre-PCR Ürün saflaştırılması
Astar enzimatik sindirim Arıtma (üretmektedir protokoller sonrasında spin kolon)
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR Arıtma Kiti | Qiagen | 28004 |
Not: bizim elimizde özel enzimatik temizleme başarıyla kaldırıldı primerler da sıcaklık 80 ° C inaktivasyonu adım sırasında yükselir kısa ürünlerin denatüre muhtemelen nedeniyle kısmi ön amplifiye ürün kısmi bozulma açtı ama. enzim. Isı inaktivasyonu kaçınmak ve doğrudan dönüş sütunlarını kullanarak enzimatik reaksiyon PCR ürünleri arındırıcı ürün bozulma olmadan herhangi bir astar kaldırır.
- 2 ul ExoSAP-IT ile 5 ul-PCR sonrası ürün karıştırın.
- 37 ° C'de 15 dakika kalan astar ve nükleotidlerin aşağılamak için.
- PB Tampon eklenmiştir pH göstergesi durumunda, PCR reaksiyonu ve mix 1 hacim Tampon PB 5 birimleri karışımı rengi sarı olup olmadığını kontrol edin.
- 2 ml toplama tüpü MinElute sütun uygun bir rafa yerleştirin.
- 1 dakika için MinElute bir sütun ve santrifüj için örnek uygulayın.
- Flow-through atın, aynı tüpe geri MinElute sütun ve 1 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj 750 ul Tampon PE MinElute sütun ekleyin.
- Flow-through atın ve aynı tüp MinElute sütun yerine geri. Maksimum hızda 1 dakika için ek bir sütun santrifüjleyin.
- Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp MinElute sütuna yerleştirin.
- DNA Zehir, cen sonra, membran merkezine 10 ul DEPC arıtılmış su eklemek sütun, 1 dakika boyunca bekletin ve1 dakika için trifuge.
8. Fludigim 96,96 QRT-PCR Profilleme
| Reaktifin Adı | Şirket | / Cat eşya # | Yorumlar |
| Fluidigm 96,96 Dinamik Dizi Seti 96,96 dinamik bir dizi 96,96 kontrolü hattı sıvısı 20x Yükleniyor Reaktif | Fluidigm Corporation'ın | ||
| Mix Evrensel Ters Primer (1 mcM) İleri Primer (1 mcM) TaqMan Probe (0.2 mcM) | Integrated DNA Technologies | Özel | Seri çekim (1) |
| 2x Evrensel PCR Master Mix NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Astar 96,96 Dinamik Dizi IFC
- Her birine çip üzerinde akümülatörlerin kontrolü hattı sıvısı (150 ul) enjekte edilir.
- IFC (entegre akışkan devresi) denetleyicisi yonga ve yonga içine asal kontrol hattı sıvı Başbakan (136x) komut dosyası çalıştırın.
Not: Chip paket açıldıktan sonra 24 saat kullanılması gerekir. Çip veya girişler kontrol hattı sıvı çip kullanılamaz hale getirir bu yana kontrol hattı sıvı dökmemeye emin olun. Chip emişli 60 dakika içinde yüklü olması gerekiyor.
2. Numunelerin hazırlanması
2.1 Ön-Numune Hazırlama
Tek bir plastik tüp, örnek Ön-Mix (giriş için birimler) yapmak için aşağıdaki tabloyu bileşenleri birleştirir.
| 2x TaqMan Evrensel Master Mix | 2.5 ul |
| 20x Yükleniyor Reaktif | 0.25 ul |
Not: Final Cilt, 2.75 ul pipet için geçkin kayıpları vazgeçmek gibi
2.2 Örnek-Hazırlık
96 birleştirin ön-örnek karışımı (giriş için cilt) ile her bir örnek biçimi.
| Ön-Örnek-Mix | 2.75 ul |
| Örnek | 2.25 ul |
Not: kısaca sıvı toplamak için Vortex ve santrifüj 96 plaka.
Final Hacim, giriş 5 ul başına biraz daha yüksek hacim hazırlarken dikkate kaybı pipetleme alır.
2.3 13x Tahliller hazırlanması
- 96 plaka, 13x testleri hazırlamak için kullanın. Aşağıdaki tabloda, 13x 1x konsantrasyonları büyütmek.
| Evrensel Ters Astar | 1 mikron (1x) | 2 sırası |
| İleri Astar * | 1 mikron (1x) | * |
| Gen-özel TaqMan Probe # | 0.2 mikron | # |
* Ileri primerler listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
TaqMan Problar Listesi bulunabilir http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- % 0.25 son Tween konsantrasyon için, Tween ile 13x deneyleri yeni bir 96 plaka alikotları Birleştirin
Not: giriş ortalama Final Cilt ses aktarımı sırasında kaybı dikkate almak için yeterli hacmi (5.5 ul) hazırlamak, 5 ul. - Iyice karıştırınız kabarcıkları kaçınarak ve sıvı toplamak için kısaca santrifüj.
3. Yükleme çip
Not: örnekler ve testlerin çip doğru konumlandırma sağlamak doğru yükleme için izin için. Sol üst köşesine çentik hizalamak için uygundur.
Tüm tahlil sağlanması ve örnek çözümler çip yüklemeden önce karıştırılır. 96 plaka bunu ve çip yüklemeden önce plaka spin uygundur. Daha sonra başvurmak için çip pipetleme harita farkında olun.
Kullanılmayan örnek girişler 2.75 ul örnek Mix ve 2.25 ul DNA serbest su ile doldurulmalıdır.
Kullanılmayan tahlil girişler 2.5 ul tahlil yükleme reaktif ve 2.5 ul su ile doldurulmalıdır.
Hava kabarcıkları almaktan kaçınması pipetleme ise ilk durağı geçmiş gitmeyin.
- Yükledikten sonra örnekleri ve testleri (Vgiriş için olume: 5 ul) Yük Mix komut dosyası (136x) komut dosyası örnekleri ve testlerin çip içine yüklemek için çalıştırın.
- Script bittikten sonra, ICF denetleyicisi yonga çıkarın.
- Yüklenen çip alt mavi koruyucu film Peel.
- Çip yüzeyine herhangi bir toz parçacıkları veya enkaz çıkarın.
4. 96,96 QRT-PCR
- BioMark sistem çip transfer ve aşağıdaki amplifikasyon koşulları:
55 ° C 2 dk, 95 ° C, 10 dakika, 15 s ve 1 dakika boyunca 55 ° C - 95 ° C 40 döngü ile takip. - Yazılım veri toplama için üretim protokolü uygulayın.
5. QPCR analiz yazılımı kullanma
RT-PCR sonra sahipli yazılım, her bir kuyu için amplifikasyon eğrileri, ısı haritaları ve Ct değerlerini sağlar. Veri analizi için yazılım kılavuzuna başvurun.
9 - Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Deneysel iş akışının şematik bir gösterimi. Gösterilen multipleks QRT-PCR protokolü bir adım-adım açıklama, önce aşırı primerlerin multipleks ters transkripsiyon (Adım C) ve multipleks amplifikasyon arıtma (Adım D) (D Step) de dahil olmak üzere gerçek zamanlı algılama (Adım F), QRT-PCR için cDNA şablon saflaştırılmış. FP: microRNA özgü ileri astar, URP: Evrensel ters astar, Ar-SLP: microRNA özgü ters kök döngü astar.
Daha büyük bir görüntü için buraya tıklayın.
Şekil 2. Polyacryamide jel arıtma pre-PCR ürününün boyutu ön-PCR Gruplar sonra Mah-PCR şablonu sadece WT örnekleri görüldüğü gibi, değil microRNA eksik DGCR8 / veya Dicer / - örnekleri (oklar) sonra 96-plex RT ve 12 döngüleri amplifikasyon. Tüm örnekler (yıldız), bilinmeyen (ok başları) ve aşırı primerler non-spesifik ürünler olduğunu unutmayın.
Şekil 3. Arıtma multipleks amplifikasyon sonra Mah-PCR sonuçlarının doğruluğunu büyük ölçüde geliştirir a) WT Mesc göreceli ekspresyon düzeyleri Karşılaştırma Dgcr8 - / - (kanonik microRNA eksik) Mesc daha microRNA 1) algılama ve 2) yalancı pozitif kaybı ortaya ön-PCR ürünü primerler arındırıcı sonra arka planlar - / - Dgcr8 sinyaller. b) arıtma sonra, her iki DGCR8 göreceli ekspresyon düzeyleri - / - / WT ve Dicer - / - / WT yanlış pozitif sinyaller kaybı ve nadir Dgcr8 bağımsız / Dicer bağımlı küçük RNA'lar (MIR-320, uygun kategorize izin - 484, -877) 5
Şekil 4. Fluidigm yüksek verimli QRT-PCR miRNA profilleme Örnek ekran prostat kanseri hasta serumlarının miRNA düzeyleri değişiklik için ekrana 96,96 Fluidigm QRT-PCR mircoRNA profil vurdu. Gerçek zamanlı qPCR analiz yazılımı amplifikasyon eğrileri, renk kodlu ısı haritalar ve bisiklet eşiği (Ct) sağlar.
Discussion
miRNA'lar kısa (18-24 nükleotidler), non-coding RNA gen ekspresyonu düzenleyen istikrarsızlaştırıcı hem haberci RNA (mRNA) ve inhibe çeviri post-transkripsiyonel, 6 insan genlerinin en az üçte biri korunmuş içeren Aslında miRNA . kendi 3'UTR bağlayıcı siteleri ve hücre kaderinin kararları, doku homeostazı ve kanser gibi hastalıkların önemli bir katkı pluripotency, proliferasyonu ve apoptozis genlerinin miRNA'lar belirgin etkileşimler göstermektedir. 6,7 Dolayısıyla doğru microRNA ifade profilleri geniş bir ilgi.
QRT-PCR miRNA ifade profil protokol 2 yayınlanan multipleks test etmek için, negatif kontrol olarak küçük RNA eksik Mesc kullanıldı . / - DGCR8 / - Dicer ise hücreler, tüm kanonik microRNA eksik. Hücreleri kanonik ve non-canoncial micoRNAs eksikliği 8,9
/ - - DGCR8 MES-vahşi tip düzeyleri karşılaştırıldığında hücreler, birçok yabani tip hücrelerin 11 10 microRNA tespit edilmedi ifade doğruluk eksikliği ortaya çıkardı. Hatta bazıları nakavt hücreleri (Şekil 3a) göre daha düşük ekspresyon düzeyleri gösterdi. Biz, doğruluk eksikliği singleplex RT-kantifikasyon önce iki ardışık multipleks adımları büyük astar, carry-over (RT-PCR öncesi) neden olabileceğini varsaydık. Ancak, RNA başlangıç konsantrasyonu sınırlıdır, özellikle multipleks öncesi amplifikasyon sinyal gücünü arttırmak için gereklidir. / - Yerli poliakrilamid jeller (Şekil 2) boyutu seçimi primerler pre-PCR ürünleri arındırarak, Dgcr8 hem daha microRNA ve yanlış pozitif sinyallerin kaybı tespit doğruluğu önemli bir gelişme gösteren ve Dicer - / Ayrıca arka planlar (Şekil 3a ve 3b) nadir Dgcr8 Independent / Dicer bağımlı küçük RNA'lar (Şekil 3b) 11 doğru kategorizasyonu için izin değiştirilmiş QRT-PCR yaklaşım. Bu nedenle pre-PCR ürününün uzak aşırı primerler arındırmak için ek bir adım büyük multipleks astar kullanılarak örnek başına ayarlar, özellikle de açıkça avantajlıdır.
Preamplifikatörde döngülerinin optimal sayıda giriş RNA konsantrasyonları belirlenir. Belirli bir denemenin hususlar değil altında veya denge overamplify yönlendirilmelidir.
Binden fazla bilinen microRNA ile, standart 384-iyi, özellikle birden çok örnekleri karşılaştırarak tabak, geniş microRNA profili için en uygun olmayabilir. Fluidigm Dinamik Dizi IFC nanoliter ölçek (6.7 nL) tek bir deney (9216 reaksiyonlar) 96 farklı microRNA karşı 96 kadar bireysel örnekleri test pipetleme adımları ve gerekli kimya önemli bir azalma sağlar. Her çalışma için analiz yazılımı amplifikasyon eğrileri, renk kodlu ısı haritaları ve çevrim eşik değerleri (Ct) sağlar. Eş zamanlı geniş çaplı bir profil deneysel sapmaların azaltır ve küçük RNA denetimleri kullanan diğer normalleşme stratejileri performans anlamına ifade değer normalleştirme, sağlar . 12
Önceden atanmış TaqMan problar ile piyasada bulunan 384 platformları ile karşılaştırıldığında, ısmarlama primer setleri ile yüksek verim profil platformu kombinasyonu yüksek deneysel esneklik sunar.
Dinamik Dizi platformu ile birlikte optimize edilmiş multipleks QRT-PCR yaklaşımı başarıyla bize aynı anda 384 miRNA (Şekil 4) düzeylerindeki değişiklikler için 48 prostat kanserli hasta serumlarının ekrana ve kontrollerde başak olmadan (yani sentetik microRNA) veri normalleştirmek için izin verdi. 11
Numunelerin hazırlanması profil sonuçları adımları artışa rağmen, açıklanan yaklaşım, hatta sınırlı başlangıç materyali ile bir zaman ve maliyet-etkin miRNA ifade seviyeleri için büyük bir örneklem kümesi profil yüksek kapasiteli yöntemi.
Disclosures
Alan Mir Fluidigm Corporation'ın bir çalışanı. Aksi halde, ifşa etmek için herhangi bir mali çıkarları var.
Acknowledgments
Biz Blelloch laboratuar metin üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH (K08 NS48118 ve R01 NS057221), California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (Tohum Hibe RS1-00161, Yeni Fakülte Ödülü RN2-00.906) ve Pew Charitable Trust RB fon ve FM desteklenmiştir. Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
