Summary
כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.
Abstract
מעורבות רחבה של miRNAs בתהליכים קריטיים הבסיסית, התפתחות רקמת homoeostasis ומחלות הוביל עניין הגואה בקרב במחקר קהילות התרופות. כדי ללמוד miRNAs, חיוני כי כימות של רמות microRNA מדויק ויציב. על ידי השוואת wild-type ל-RNA קטנים לקוי עכבר לתאי גזע עובריים (המסקלין), אנו גילה חוסר דיוק וחוסנם קודמות qRT-PCR טכניקות שפורסם זמנית. כאן אנו מתארים שיטת אופטימיזציה, כולל טיהור משם primers מוגזמת מן השלבים הקודמים זמנית לפני גילוי singleplex זמן אמת, אשר מגדיל באופן דרמטי את הדיוק ואת החוסן של הטכניקה. יתר על כן, נסביר כיצד לבצע את הטכניקה על שבב microfluidic בעוצמות nanoliter מפחית באופן משמעותי את עלויות מגיב והיתרים יעיל זמן מירנה גבוהה התפוקה פרופיל הביטוי.
Protocol
1. RNA-Extraction: תאים שגודלו monolayer
(בעקבות פרוטוקול של היצרן באמצעות TRIzol).
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # |
| TRIzol פתרון | Invitrogen | 15596-018 |
| איזופרופיל אלכוהול | סיגמא אולדריץ | 1907-1964 |
| כלורופורם | סיגמא אולדריץ | C 2432 |
| אתנול | ||
| RNAse מים חינם |
Homogenization
- Homogenize תאים ישירות על צלחת את התרבות על ידי הוספת 1 מ"ל Trizol פתרון לכל 10 אזור 2 ס"מ צלחת, במערבולת Trizol סביב פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת.
שלב ההפרדה
- דגירה מדגם הומוגני במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- העברת לתוך צינור שכותרתו, להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם לכל TrizolSolution 1ml ולנער צינור נמרצות ביד במשך 15 שניות.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
- צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות 2 ° C. לאחר צנטריפוגה תערובת מפריד לשלב האדום התחתון, שלבי הביניים ושלב צבע מימית העליון, המכיל את הרנ"א צריך להיות 60% מנפח הפתרון הכולל Trizol.
RNA רטיבות
- העברת מימית, המכילה רנ"א שלב לתוך צינור, שכותרתו טרי.
- המשקע RNA על ידי הוספת 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופילי לכל 1 מ"ל של פתרון Trizol.
- דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 10 דקות 2 ° C.
RNA-לשטוף
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant מן הצינורות.
- שטפו את גלולה RNA (בצד התחתון של הצינור) על ידי הוספת לפחות 1 מ"ל של אתנול 75% לכל 1 מ"ל של פתרון Trizol, מערבולת.
- צנטריפוגה XG ב 7500 למשך 5 דקות 2 ° C.
RNA elution
- בטל supernatant ו צנטריפוגות שוב למשך דקה 1. הסרה עודפת של נוזל.
- אוויר יבש גלולה למשך 5-10 דקות.
הערה: על RNA מיובש קשה solubilize. - Redissolve גלולה במים RNase בחינם על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה ו דגירה במשך 10 דקות על 55 ° C.
- מדידת ריכוז RNA (A260/280 יחס) באמצעות ספקטרופוטומטר ™ Nanodrop.
- חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש.
2. RNA-Extraction: סרום
(פרוטוקול בעקבות mirVana PARIS יצרן של קיט שונה על ידי מיטשל et al. 1)
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # | תגובות |
| מיר ונה PARIS Kit הפתרון Denaturing 2X חומצה פנול: כלורופורם לשטוף מירנה פתרון 1 לשטוף מירנה פתרון 2 / 3 | Ambion | AM1556 | השתנה פרוטוקול |
| 2-mercaptoethanol | סיגמא אולדריץ | M7522 | |
| אתנול | |||
| DEPC טיפול מים |
כימית אופן ההכנה:
- הוסף 375 μl של mercaptoethanol-2 ל 'פתרון Denaturing 2X ומערבבים היטב.
- הוסף 21 מ"ל של אתנול 100% הפתרון מירנה לשטוף 1.
- הוסף 40 מ"ל של אתנול 100% הפתרון מירנה לשטוף 2 / 3.
לדוגמה אופן ההכנה:
- הפשירי מדגם בסרום על הקרח.
Homogenization
- מערבבים 300 מדגם μl עם נפח שווה (300 μl) הפתרון Denaturing 2X (צריך להיות בטמפרטורת החדר) ו מערבולת.
- דגירה התערובת על קרח למשך 5 דקות.
- הוספת נפח של חומצה פנול: כלורופורם שווה מהנפח הכולל של lysate המדגם בתוספת פתרון Denaturing 2X (600 μl).
חשוב: אין להשתמש חיץ מימית שנמצאת על גבי חומצה פנול: כלורופורם. - וורטקס התערובת במשך 60 שניות.
- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות במהירות המרבית (> 10000 XG). לאחר צנטריפוגה תערובת מפריד לשלב מימית העליון, שלבי הביניים ושלב אורגני נמוך.
- הסר aqueשכבה על גבי היחידות הארגוניות (צריך להיות 300-500 μl לרבות שכבת proteinacious "מעורפל").
- Re-לחלץ שכבה מימית כמו קודם שוב על ידי הוספת כלורופורם.
חשוב: שכבה מימית ממוצא השני הוא שגרתי קטן נפח (250 μl). הערה נפח התאושש.
הכנת סופי RNA-בידוד (RNA סה"כ)
- מחממים (95 ° C) nuclease ללא מים.
- אתנול 100% חייבת להיות בטמפרטורת החדר.
סופי RNA-בידוד (RNA סה"כ)
- הוסף 1.25 כרכים של 100% אתנול לשלב מימית התאושש (למשל, אם 300 μl נמצאה, להוסיף 375 אתנול μl) ומערבבים היטב.
- עבור כל דגימה, במקום מחסנית המסנן לתוך אחד הצינורות האוסף.
- פיפטה lysate על המסנן.
- צנטריפוגה (10,000 XG) למשך 30 שניות, להשליך את הזרימה דרך, צנטריפוגה שוב למשך 30 שניות להחליף את מחסנית מסנן לתוך הצינור אוסף אותו.
RNA-Wash
- החל מירנה 700 μl לשטוף פתרון 1 למחסנית צנטריפוגות לסנן למשך 15 שניות, להשליך את הזרימה דרך מהצינור תאסוף, להחליף את מחסנית מסנן לתוך הצינור אוסף אותו.
- החל מירנה 500 μl לשטוף פתרון 2 / 3, צנטריפוגה למשך 15 שניות, להשליך את הזרימה דרך וחזור עם μl 500 השני של הפתרון שטוף 2 / 3.
- מחק את הזרימה דרך ויבש ספין של 1-2 דקות.
- מחסנית מקום מסנן בצינור אוסף טרי, חלות 100 μl מים RNAse חינם (95 ° C), כובע דגירה קרוב במשך 2 דקות.
- צנטריפוגה עבור ~ 2 דקות כדי לשחזר את רנ"א.
- חנות ב -80 ° C עד השימוש.
3. ריכוז של RNA-Solution (5X)
(בעקבות פרוטוקול של ייצור)
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # |
| MICROCON התקנים מסנן צנטריפוגלי, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC טיפול מים |
התקן: Microcon Ultracell YM-3, לכיבוי אס נוקלאוטידים DS: 10
נפח: נפח הרצויה של פתרון RNA מחדש מרוכז תלויה בתכנון הניסוי צריך לכלול ניסויים שליטה.
- הכנס מדגם מאגר Microcon לתוך בקבוקון פתרון פיפטה לתוך המאגר.
הערה: אל תיגע הממברנה. - צנטריפוגה עבור 185 דקות 4 ° C עם 14,000 מקסימלית x ז
הערה: בקבוקון קבוצה עם הלהקה סדק כלפי הרוטור. - נפח פיפטה הרצויה של המים חופשי RNAse (למשל 20 μl) על המאגר, המאגר מקום הפוכה לתוך בקבוקון ספין חדש למשך 3 דקות 4 ° C עם מקסימאלית 3000 x ז
- חנות ב -80 ° C עד השימוש.
4. Reverse Transcription
(בעקבות פרוטוקול טאנג et al. 2 עם שינויים.)
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # | תגובות |
| קיבולת גבוהה cDNA ארכיון ערכת 10x הצפת בארכיון cDNA dNTP (100 מ"מ) Moloney Murine נגיף לוקמיה (MMLV) הפוך transcriptase (50 U / μl) | Applied Biosystems | 4368814 | שונה פרוטוקול |
| RNaseOUT (40 U / μl) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-Plex גזע לולאה הפוכה פריימר לערבב (40 ננומטר) * | Integrated DNA Technologies | מנהג | רצפים * |
| DEPC טיפול מים |
עוצמת התגובה: 5.5 μl
הערה: את הריכוז הסופי של גזע לולאה primers צריך להיות 1-5 ננומטר (כאן 2 ננומטר).
הכן Master-Mix (כרכים לכל תגובה) כדלקמן:
| 1. DEPC מים | 1.959 μl |
| 2. 10x RT-Buffer | 0.55 μl |
| 3. RNase אינהיביטור (40 U / μl) | 0.0715 μl |
| 4. dNTP (100 מ"מ) | 0.275 μl |
| 5. x-Plex גזע לולאה הפוכה פריימר לערבב (40 ננומטר) * | 0.275 μl |
| 6. MMLV-RT (50 U / μl) | 0.369 μl |
- מיx ו בקצרה צנטריפוגות.
- הוספת 3.5 μl Master-Mix מדגם 2 μl.
- בצעו את הפעולות הבאות RT-התגובה:
16 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואחריו 60 מחזורים ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 42 ° C למשך 30 שניות, 50 ° C עבור 1 השני, ולבסוף 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית MMLV-RT, 4 ° C ∞ . - חנות ב -20 ° C עד השימוש.
* רשימת גזע לולאה primers הפוכה ניתן למצוא בכתובת http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. קדם הגברה (Pre-PCR)
(בעקבות פרוטוקול טאנג et al. 2 עם שינויים.)
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # | תגובות |
| dNTP (100 מ"מ) | Applied Biosystems | 4368814 | כובע גבוה. ארכיון cDNA קיט. |
| 2x יוניברסל PCR מאסטר מערבבים עם NoAmpErase אונג | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-Plex קדימה תערובת פריימר (450 ננומטר) * | Integrated DNA Technologies | מנהג | רצפים * |
| פריימר הפוך אוניברסלי (100 מיקרומטר) | Integrated DNA Technologies | מנהג | רצף 2 |
| פולימראז AmpliTaqGold (5 U / μl) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 מ"מ) | |||
| DEPC טיפול מים |
עוצמת התגובה: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-Product)
הערה: קדם הגברה יש צורך לשפר את עוצמת האות, במיוחד כאשר ריכוז התחלתי של RNA הוא מוגבל. רמת קלט RNA קובע את המספר האופטימלי של Pre-PCR מחזורים. לאור היעילות היחסית אותו כל מחזור PCR צריך להכפיל את הריכוז של המוצר הסופי. מאז miRNAs כמה תהיה יותר גבוהה לידי ביטוי, להימנע במשך הרכיבה. עם זאת, מתחת הגברה יכול לגרום לאובדן של גילוי רגישות, במיוחד עבור מיקרו RNA לידי ביטוי ברמות נמוכות. בידיים שלנו 12 מחזורים הגברה מראש, באמצעות 100ng של רנ"א בסך הכל, נראה מספיק. שימוש בסרום כחומר המוצא, 12 מחזורים תוצאות ברמות מירנה לזיהוי, אבל 15 מחזורים שנראה מעולה. לבסוף, מתחיל עם 3 ביציות (בערך 400 עמ 'רנ"א הכולל לכל הביצית 3), 16 לפני הגברה מחזורים בהצלחה אפשרה לנו מסך לביטוי רמות microRNA 4.
* רשימת primers קדימה ניתן למצוא בכתובת http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
הכן Master-Mix (כרכים לכל תגובה) כדלקמן:
| 1. 2x יוניברסל MM | 13.75 μl |
| 2. DEPC מים | 0.792 μl |
| 3. MgCl 2 (100 מ"מ) | 0.55 μl |
| 4. dNTP (100 מ"מ) | 1.1 μl |
| 5. x-Plex קדימה תערובת פריימר (450 ננומטר) | 3.06 μl |
| 6. יוניברסל RP (100 מיקרומטר) | Μl 1.375 |
| 7. פולימראז AmpliTaqGold (5 U / μl) | Μl 1.375 |
- מערבבים צנטריפוגות בקצרה.
- הוסף 22 μl Master-Mix זה 5.5 μl RT-המוצר.
- בצעו את התגובה הבאה Pre-PCR:
95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 10-18 מחזורים של 95 ° C עבור 1 s ו 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 4 ° C ∞.
6. טיהור מוצר Pre-PCR
טיהור על ידי בחירת גודל ג'ל על 10% ילידי polyacrylamide
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # |
| 40% Acrylamide / פתרון ביס | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 נ"ב סולם DNA | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR ג'ל זהב חומצות גרעין כתם 10,000 X להתרכז DMSO | Invitrogen | S11494 |
| גליקוגן (20 מ"ג / מ"ל) | רוש | 10 901 393 001 |
| הצפת-EB | ||
| Ammoniumpersulfate 10% (APS) | ||
| TEN-Buffer | ||
| 6x אורנג' G | ||
| DEPC טיפול מים | ||
| ddH2O |
א ג'ל ההכנה
כדי להפוך את 10 מ"ל של תערובת polyacrylamide להוסיף 10%
| 1. DDH 2 O | 6.5 מ"ל |
| 2. 10x TBE | 1 מ"ל |
| 3. Polyacrylamide (40%) | 2.5 מ"ל |
| 4. APS (10%) | 80 μl |
| 5. TEMED | 4 μl |
- הכן את סולם הדנ"א:
- 0.5 μl 10 נ"ב סולם DNA
- 4.5 חוצץ μl (EB)
- 1 μl 6x אורנג' G
- הוספת 5.5 μl G אורנג' 6x לכל מוצר 27.5 Pre-PCR μl.
ב הפעל ג'ל
- הפעל ג'ל עם 150V עבור 55-60 דקות.
הערה: כחול Bromophenol כאינדיקטור רץ עם האזור 20bp.
ג הכתם ג'ל
- הכתם ג'ל עם SYBR-Gold במשך 25 דקות על שייקר.
הערה: SYBR-זהב הוא רגיש לאור.
ד גזור ג'ל
- לגזור Pre-PCR הלהקה מוצר 60-80 נ"ב והעברת צינור שכותרתו.
הערה: הלהקה נמוך Pre-RNA PCR מוצרי הזנה לא יהיה גלוי. - קראש הלהקה ג'ל (צינור למשל צנטריפוגה צינור).
ה לחלץ מחדש cDNA
- הוסף 300 μl TEN-Buffer ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות על הכתף.
- העברת נוזל לצינור אוסף שכותרתו, להוסיף עוד 300 μl TEN-Buffer אל שפופרת ג'ל המכילים ועל דגירה בבת 4 ° C במשך הלילה על הכתף.
- לשאוב נוזלים הנותרים, להעביר צינור איסוף מתויג כמו קודם וציין את נפח התאושש מוחלט.
ו אתנול רטיבות
- הוסף 3 כרכים של אתנול החדר לטמפרטורה של 100%.
- הוספת 0.5 μl גליקוגן (20 מ"ג / מ"ל).
- וורטקס.
- לדגור על קרח יבש לפחות 2 שעות או -80 ° C במשך הלילה.
- ספין microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי גלולה cDNA.
- דאמפ נוזל, להוסיף 700 בטמפרטורת החדר μl 75% אתנול ו ספין במשך 10 דקות.
- דאמפ נוזלים ספין שוב במשך 5 דקות.
- תמצצי את supernatant מבלי להפריע גלולה ואוויר יבש במשך 10 דקות.
- Redissolve גלולה במים נקיים.
הערה: רצוי נפח הפתרון cDNA מרוכז תלויה בתכנון הניסוי צריך לכלול ניסויים שליטה.
7. טיהור מוצר Pre-PCR
טיהור על ידי עיכול אנזימטי של primers ואחריו טור ספין (בעקבות מייצרת פרוטוקולים)
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR ערכת טיהור | Qiagen | 28004 |
הערה: ידינו הבלעדית האנזימטית לנקות primers הוסר בהצלחה, אבל הביאה גם ירידה חלקית של המוצר מוגבר, אולי בשל denaturing חלקית של המוצרים קצר הטמפרטורה עולה עד 80 מעלות צלזיוס במהלך השלב איון של האנזים. הימנעות איון חום ישיר מטהרים את המוצרים PCR מן התגובה האנזימטית באמצעות עמודות ספין מסירה את כל פריימר ללא השפלה המוצר.
- מערבבים 5 מוצר μl שלאחר PCR עם 2 μl ExoSAP-IT.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לבזות primers הנותרים נוקלאוטידים.
- הוסף 5 כרכים של הצפת PB נפח 1 התגובה PCR ומערבבים, אם מדד ה-pH אני נוספה הצפת PB, לבדוק את הצבע של התערובת הוא צהוב.
- המקום טור ב MinElute צינור סיפק 2 אוסף מ"ל במעמד מתאים.
- החל מדגם לעמודה צנטריפוגות MinElute ובמשך דקה 1.
- בטל זרימה דרך, במקום טור MinElute בחזרה לתוך הצינור אותו ולהוסיף 750 הצפת PE μl לעמודה MinElute לכבס צנטריפוגות במשך דקה 1.
- בטל זרימה דרך ומקום האחורי טור MinElute בצינור זהה. צנטריפוגה העמודה דקה 1 נוסף במהירות המרבית.
- מניחים את הטור ב MinElute צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל.
- כדי elute DNA, להוסיף 10 μl מים מטופלים DEPC למרכז הממברנה, בואו בעמודה לעמוד במשך דקה 1, ולאחר מכן CENtrifuge דקה 1.
8. Fludigim 96.96 qRT-PCR פרופיל
| שם מגיב | חברה | פרוד / חתול # | תגובות |
| Fluidigm 96.96 מערך דינמי Kit 96.96 דינמי מערך 96.96 קו נוזל שליטה 20x טוען מגיב | Fluidigm Corporation | ||
| מיקס של יוניברסל פריימר הפוך (1 מיקרומטר) פריימר Forward (1 מיקרומטר) TaqMan בדיקה (0.2 מיקרומטר) | Integrated DNA Technologies | מנהג | רצף (1) |
| 2x יוניברסל PCR מאסטר מיקס עם NoAmpErase אונג | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. תחול IFC 96.96 מערך דינמי
- הזרק קו נוזל שליטה (150 μl) לתוך כל אחד ומצברים על השבב.
- המקום שבב לתוך הבקר IFC (מעגל משולב fluidic) ולהפעיל את התסריט (136x) ראש הממשלה כדי לשלוט נוזל קו לתוך השבב.
הערה: Chip צריכה להיות בשימוש 24 שעות לאחר פתיחת החבילה. הקפד לא לשפוך את הנוזל קו השליטה מאז קו נוזל שליטה על השבב או פתחי הכניסה הופך השבב שמיש. Chip צריכה להיות טעון בתוך 60 דקות של תחול.
2. הכנת דוגמאות
2.1 טרום מדגם הכנה
בתוך צינור פלסטיק חד פעמיות, לשלב את המרכיבים בטבלה שלהלן כדי להפוך את Sample-Pre-Mix (כרכים לכל מפרצון).
| 2x TaqMan יוניברסל מאסטר מיקס | 2.5 μl |
| 20x טוען מגיב | 0.25 μl |
הערה: כרך הסופי הוא 2.75 μl, כמו overage עבור פיפטה לוותר על הפסדים
2.2 לדוגמה, הכנת
שלב ב 96 גם כל פורמט דגימה עם תערובת טרום המדגם (כרכים לכל מפרצון).
| Pre-Sample-Mix | 2.75 μl |
| מדגם | 2.25 μl |
הערה: וורטקס ו 96 צנטריפוגות צלחת גם לזמן קצר כדי לאסוף נוזלים.
נפח סופי לכל μl 5 מפרצון, לקחת pipetting הפסד בחשבון על ידי הכנת נפח גבוה מעט יותר.
2.3 הכנת מבחני 13x
- השתמש צלחת 96 היטב כדי להכין את מבחני 13x. 1x ריכוזי בטבלה להלן, בהיקף של עד ל 13x.
| הפוך פריימר יוניברסל | 1 מיקרומטר (1x) | רצף של 2 |
| פריימר קדימה * | 1 מיקרומטר (1x) | * |
| ג'ין ספציפי TaqMan Probe # | 0.2 מיקרומטר | # |
* רשימת primers קדימה ניתן למצוא בכתובת http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
# רשימה של בדיקות TaqMan ניתן למצוא בכתובת http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- שלב ב 96 aliquots חדש צלחת יפה של מבחני 13x עם Tween ריכוז 0.25% Tween הסופי
הערה: נפח סופי לכל מפרצון הוא 5 μl, להכין נפח מספיק (5.5 μl) לקחת את ההפסד במהלך ההעברה נפח בחשבון. - מערבבים היטב, הימנעות בועות צנטריפוגות בקצרה לאיסוף נוזלים.
3. טוען את השבב
הערה: על מנת לאפשר טעינה נכונה של דגימות מבחני להבטיח את המיקום הנכון של השבב. זה נוח ליישר את חריץ לפינה היד בפינה השמאלית העליונה.
ודאו כי כל assay ופתרונות מדגם מעורבבים לפני טעינת שבב. זה נוח לעשות את זה צלחת 96 באר ספין את הצלחת לפני טעינת שבב. שימו לב המפה pipetting שבב לעיון מאוחר יותר.
פתחי הכניסה מדגם שאינם בשימוש צריך להיות מלא עם מיקס מדגם μl 2.75 ו 2.25-DNA μl מים בחינם.
פתחי הכניסה assay שאינם בשימוש צריך להיות מלא עם 2.5 מגיב טעינת μl assay ו -2.5 μl מים.
אל תלך בעבר להפסיק הראשון בעוד pipetting כדי למנוע החדרת בועות אוויר.
- לאחר טעינת דגימות מבחני (Volume לכל כניסה: 5 μl) בטווח מערבבים טען סקריפט (136x) סקריפט כדי לטעון את דגימות מבחני לתוך השבב.
- אחרי התסריט סיימה, להסיר את השבב מבקר ICF.
- פיל הסרט המגן הכחול התחתון של השבב טעון.
- הסר את כל חלקיקי אבק או פסולת ממשטח שבב.
4. 96.96 qRT-PCR
- מעבירים את שבב למערכת BioMark ולהשתמש התנאים הבאים הגברה:
55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו - 55 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. - עקבו פרוטוקול של ייצור עבור איסוף נתונים תוכנה.
5. באמצעות תוכנת ניתוח qPCR
לאחר RT-PCR תוכנה קניינית מספקת עקומות הגברה, מפות חום וערכים Ct גם עבור כל אחד. עיין במדריך תוכנה לניתוח נתונים.
9. נציג תוצאות:
באיור 1. ייצוג בתרשים של עבודה ניסיונית. מוצג תיאור צעד אחר צעד של qRT-PCR זמנית פרוטוקול, כולל טיהור (ה 'שלב) של primers יתר זמנית של שעתוק הפוך (שלב C) preamplification זמנית (שלב ד') לפני איתור בזמן אמת (שלב F), וכתוצאה מכך תבנית cDNA מטוהרים עבור qRT-PCR. FP: פריימר ספציפי microRNA קדימה, URP: פריימר הפוך אוניברסלי, R-SLP: הפוך ספציפי microRNA גזע לולאה פריימר.
לחצו כאן לתמונה מוגדלת.
איור 2. . לטיהור ג'ל Polyacryamide של תבנית qRT-PCR לאחר טרום PCR להקות של גודל מראש PCR מוצר נתפסים באופן בלעדי דגימות WT, אך לא DGCR8 microRNA לקוי - / - או דייסר - / - דגימות (חיצים) לאחר 96-Plex RT ו - 12 מחזורים של preamplification. שים לב כי הלא ספציפית של מוצרים ממקור לא ידוע (ראשי חץ) ו primers מופרז נמצאים בכל דגימות (כוכבים).
איור 3. טיהור לאחר preamplification זמנית משפר בהרבה הדיוק של qRT-PCR תוצאות השוואה) של רמות הביטוי היחסי של WT המסקלין כדי Dgcr8 -. / - (MicroRNA הקנונית לקוי) המסקלין חושף 1) זיהוי של רנ"א יותר 2) אובדן חיובי כוזב אותות Dgcr8 - / - רקעים לאחר טיהור משם primers של מוצר מראש PCR. ב) לאחר טיהור, רמות הביטוי היחסי של שתי DGCR8 - / - / WT ו דייסר - / - / WT להציג הפסד של אותות חיובי כוזב ולאפשר הסיווג הנכון של נדיר Dgcr8 RNAs עצמאי / דייסר קטן התלוי (miR-320, - 484, -877). 5
איור 4. Fluidigm תפוקה גבוהה qRT-PCR פרופיל מירנה. דוגמה תמונת מסך של 96.96 פרופיל Fluidigm mircoRNA qRT-PCR למסך עבור שינוי ברמות מירנה של סרה בחולה סרטן הערמונית. בזמן אמת, ניתוח תוכנה qPCR מספק עקומות הגברה, מפות בצבעים חום סף מחזור (CT).
Discussion
miRNAs קצרים (18-24 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs, אשר מסדירים ביטוי גנים שלאחר transcriptionally ידי שני RNAs שליח מערער (mRNA) ותרגום עיכוב שלהם. 6 העובדה כי לפחות שליש גנים אנושיים מכילים נשמרת מירנה מחייב-אתרים 3'UTR שלהם ואת האינטראקציות ניכר של miRNAs עם גנים שגשוג, אפופטוזיס pluripotency ומציע תרומה קריטית גורל החלטות התא, הומאוסטזיס רקמות מחלות כגון סרטן. 6,7 מדויק לכן הביטוי פרופילים microRNA הן רחבות עניין.
כדי לבדוק את multiplex שפורסם qRT-PCR ביטוי מירנה פרופיל פרוטוקול 2 השתמשנו קטן המסקלין RNA לקוי כפקדי שלילית. DGCR8 - / - תאים חסרים כל רנ"א הקנוני, בעוד דייסר - / -. תאים חוסר micoRNAs הן הקנוני והלא canoncial 8,9
השוואת רמות סוג בר MES ל DGCR8 - / - תאים, חשפנו חוסר דיוק כמו כמה הביעו 10 רנ"א לא התגלו בטבע מסוג תאים 11. חלקם אפילו הראו רמות ביטוי נמוכות יחסית לתאים בנוקאאוט (איור 3a). החוקרים שיערו כי חוסר דיוק עלול להיגרם על ידי פריימר המאסיבית לשאת מעל שני צעדים רצופים זמנית (RT ו - Pre-PCR) לפני כימות-RT singleplex. עם זאת, זמנית מראש הגברה יש צורך לשפר את עוצמת האות, במיוחד כאשר ריכוז התחלתי של RNA הוא מוגבל. על ידי טיהור הרחק מראש PCR מוצרים primers על ידי בחירת גודל על ג'לים polyacrylamide יליד (איור 2), נוכל להדגים שיפור ניכר דיוק ידי גילוי רנ"א יותר הפסד של אותות חיובי כוזב הן Dgcr8 - / - ו דייסר - / - רקע (איורים 3 א ו 3 ב) בנוסף, שונה qRT-PCR גישה מותר הסיווג הנכון של נדיר Dgcr8 RNAs עצמאי / דייסר קטן התלוי (איור 3 ב) 11. לכן צעד נוסף כדי לטהר primers מוגזמת הרחק מוצר טרום PCR יש יתרון ברור, במיוחד כאשר באמצעות פריימר זמנית גדול ערכות לדגימה.
מספר אופטימלי של טרום ההגברה מחזורים נקבעת על ידי ריכוז RNA קלט. האיזון כדי לא מתחת או overamplify צריך להיות מונחה על ידי הפרטים של הניסוי הספציפי.
עם יותר מאלף רנ"א ידוע, שימוש רגיל 384 גם הצלחות לא יכול להיות אופטימלי עבור פרופיל microRNA נרחב, בייחוד כאשר משווים דגימות מרובות. IFC Fluidigm מערך דינמי מאפשר, עם ירידה משמעותית של צעדים pipetting וכימיה הצורך, בדיקה עד 96 דגימות בודדות כנגד 96 רנ"א שונים בניסוי יחיד (9216 תגובות) בקנה מידה nanoliter (6.7 NL). בשביל להריץ כל תוכנה מספקת ניתוח עקומות הגברה, מפות בצבעים חום סף מחזור ערכים (CT). פרופיל סימולטני בקנה מידה גדול מפחית סטיות ניסיוני מאפשר נורמליזציה הערך הממוצע הביטוי, אשר מחוץ מבצע אסטרטגיות נורמליזציה אחרים העושים שימוש קטן שולטת RNA. 12
לעומת 384 פלטפורמות זמין מסחרית היטב מראש מוקצה בדיקות TaqMan, השילוב של פלטפורמת תפוקה גבוהה עם פרופיל מחוייט קובע פריימר מציעה גמישות גבוהה ניסיוני.
זמנית אופטימיזציה qRT-PCR גישה בשילוב עם פלטפורמת מערך דינמי מותר בהצלחה לנו בו זמנית במסך 48 סרטן הערמונית סרה המטופל לשינויים ברמות של מירנה 384 (איור 4) ו לנרמל את הנתונים ללא עלייה שולטת (כלומר סינתטי רנ"א). 11
למרות הגידול של צעדים מן הכנה דוגמאות לתוצאות פרופיל, הגישה המתוארת היא זמן וחסכונית שיטת תפוקה גבוהה לפרופיל קבוצות מדגם גדול של רמות ביטוי מירנה, אפילו עם חומר המוצא מוגבל.
Disclosures
אלן מיר הוא עובד של התאגיד Fluidigm. אחרת, אין לנו אינטרסים כלכליים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מעבדה Blelloch עבור להעיר על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות RB מ-NIH (K08 NS48118 ו R01 NS057221), קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) (Seed גרנט RS1-00161, פרס הפקולטה חדש RN2-00906) ואת האמון Pew Charitable ו-FM מן Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
