Summary
Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.
Abstract
La large participation des miARN dans les processus critiques qui sous-tendent le développement, les tissus homéostasie et la maladie a conduit à un intérêt surgi chez les communautés scientifiques et pharmaceutiques. Pour étudier les miRNAs, il est essentiel que la quantification des niveaux microARN est précise et robuste. En comparant type sauvage aux petits ARN des cellules déficientes souches embryonnaires de souris (CESM), nous a révélé un manque de précision et de robustesse dans les précédentes publiées multiplexe qRT-PCR. Ici, nous décrivons une méthode optimisée, y compris la purification de suite amorces excessive à partir des étapes précédentes avant la détection multiplex singleplex temps réel, ce qui augmente considérablement la précision et la robustesse de la technique. Par ailleurs, nous expliquons comment effectuer la technique sur une puce microfluidique à des volumes nanolitre réduit considérablement les coûts de réactif et le temps le permet effective des profils à haut débit l'expression de miRNA.
Protocol
1. ARN-Extraction: cellules cultivées en monocouche
(Selon le protocole du fabricant en utilisant TRIzol.)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # |
| Solution TRIzol | Invitrogen | 15596-018 |
| L'alcool isopropylique | Sigma-Aldrich | 1907-1964 |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Éthanol | ||
| RNAse l'eau |
Homogénéisation
- Homogénéiser les cellules directement sur la boîte de culture en ajoutant 1 ml de solution par 10 Trizol espace plat cm 2, tourbillonner le Trizol autour et pipettes haut et bas pour assurer une couverture complète de la plaque.
Séparation de phase
- Incuber l'échantillon homogénéisé pendant 5 minutes à température ambiante.
- Transférer dans un tube étiqueté, ajoutez 0,2 ml de chloroforme par 1ml TrizolSolution et secouer le tube vigoureusement à la main pendant 15 secondes.
- Incuber à température ambiante pendant 3 minutes.
- Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes à 2 ° C. Après centrifugation, le mélange se sépare en une phase inférieure rouge, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore, qui contient l'ARN et devrait être de 60% du volume total de solution Trizol.
Précipitations ARN
- Transférer la solution aqueuse, contenant l'ARN dans une phase de frais, tube étiqueté.
- Précipiter l'ARN en ajoutant 0,5 ml d'alcool isopropylique pour 1 ml de solution de Trizol.
- Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes.
- Centrifuger à 12000 xg pendant 10 minutes à 2 ° C.
ARN-wash
- Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes.
- Laver le culot d'ARN (sur le côté et au fond du tube) en ajoutant au moins 1 ml d'éthanol à 75% pour 1 ml de solution Trizol, vortex.
- Centrifuger à 7500 xg pendant 5 minutes à 2 ° C.
ARN élution
- Jeter le surnageant et centrifuger à nouveau pendant 1 minute. Retirer excessive de liquide.
- Air culot sec pendant 5-10 minutes.
Remarque: plus secs ARN est difficile à solubiliser. - Reprendre le culot dans l'eau libre de RNase par pipetage la solution haut et le bas et incuber pendant 10 minutes à 55 ° C.
- Mesurer la concentration d'ARN (A260/280 ratio) à l'aide d'un spectrophotomètre ™ Nanodrop.
- Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2. ARN-Extraction: Sérum
(Protocole suivant Mirvana PARIS Kit fabricant modifié par Mitchell et al. 1)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # | Commentaires |
| mir Vana PARIS Kit 2X solution dénaturante Acide-phénol: chloroforme Solution de lavage 1 miARN Solution de lavage miARN 2 / 3 | Ambion | AM1556 | Mis à jour le protocole de |
| 2-mercaptoéthanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Éthanol | |||
| DEPC eau traitée |
Préparation chimique:
- Ajouter 375 ul de 2-mercaptoéthanol à la solution 2X dénaturation et bien mélanger.
- Ajouter 21 ml d'éthanol à 100% à la solution de lavage miARN 1.
- Ajouter 40 ml d'éthanol à 100% à la solution de lavage miARN 2 / 3.
Préparation des échantillons:
- Dégel échantillon de sérum sur la glace.
Homogénéisation
- Mélanger 300 échantillons ul avec un volume égal (300 pi) de solution dénaturante 2X (doit être à température ambiante) et vortex.
- Incuber le mélange sur la glace pendant 5 minutes.
- Ajouter un volume d'acide-phénol: chloroforme égal au volume total de l'échantillon plus lysat la solution 2X dénaturant (600 pi).
Important: Ne PAS utiliser le tampon aqueuse qui se trouve sur le dessus de l'équilibre acide-phénol: chloroforme. - Mélange Vortex pendant 60 secondes.
- Centrifuger à température ambiante pendant 15 minutes à vitesse maximale (> 10 000 xg). Après centrifugation, le mélange se sépare en une phase aqueuse supérieure, une interphase et une phase organique inférieure.
- Retirer Aquecouche des unités d'organisation sur le dessus (qui devrait être de 300 à 500 ul y compris toute proteinacious "flou" couche).
- Re-extrait de la couche aqueuse comme avant par ajoutant encore chloroforme.
Important: La couche aqueuse de la deuxième extraction est systématiquement plus petit en volume (250 pi). Noter le volume récupéré.
Préparation de l'ARN-finale Isolement (ARN total)
- Pré-chaleur (95 ° C) eau sans nucléase.
- L'éthanol à 100% doit être à température ambiante.
Finale ARN-Isolation (ARN total)
- Ajouter 1,25 volumes d'éthanol 100% à la phase aqueuse récupérée (par exemple, si 300 ul a été récupérée, ajouter 375 ul d'éthanol) et bien mélanger.
- Pour chaque échantillon, placer un filtre à cartouche dans l'un des tubes de prélèvement.
- Pipeter le lysat sur le filtre.
- Centrifugeuse (10.000 xg) pendant 30 secondes, jeter le flux continu, centrifuger à nouveau pendant 30 secondes et remplacer le filtre à cartouche dans le tube même collection.
ARN-Wash
- Appliquer la solution 700 ul Laver miARN 1 à la cartouche filtrante et centrifuger pendant 15 secondes, jeter le flux continu du tube de collecte, et de remplacer la cartouche filtrante dans le tube même collection.
- Appliquer 500 ul Solution Laver miARN 2 / 3, centrifuger pendant 15 secondes, jeter le flux continu et de répéter avec un second 500 pi de solution de lavage 2 / 3.
- Jeter l'effluent à travers et sèche-spin pendant 1-2 minutes.
- Placez la cartouche de filtre dans un tube de collection fraîche, appliquer 100 ul RNAse eau (95 ° C), bouchon de fermer et laisser incuber pendant 2 minutes.
- Centrifuger pendant ~ 2 minutes pour récupérer l'ARN.
- Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. Concentration de l'ARN-Solution (5X)
(Suivant le protocole du fabricant)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # |
| MICROCON centrifuge dispositifs de filtrage, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC eau traitée |
Périphérique: Microcon Ultracell YM-3, coupure SS et des nucléotides DS: 10
Volume: volume désiré de ré-solution concentrée ARN dépend de la conception expérimentale et devrait inclure des expériences de contrôle.
- Insérez réservoir de l'échantillon dans le flacon Microcon et la solution la pipette dans le réservoir.
Note: Ne pas toucher la membrane. - Centrifuger pendant 185 minutes à 4 ° C avec 14 000 x g. maximale
Remarque: flacon de position avec la bande de crack vers le rotor. - Pipeter le volume désiré de RNAse eau (par exemple 20 ul) sur le réservoir, le réservoir lieu inversé dans un nouveau flacon et de spin de 3 minutes à 4 ° C avec G. maximale x 3000
- Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Reverse Transcription
(Suite à un protocole par Tang et al. 2 avec des modifications.)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # | Commentaires |
| Haute capacité de kit archive ADNc Tampon 10x ADNc archivage dNTP (100 mM) Virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV) transcriptase inverse (50 U / pl) | Applied Biosystems | 4368814 | modifiés protocole |
| RNaseOUT (40 U / pl) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-Plex mélange d'amorces reverse tige-boucle (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Personnalisé | Séquences * |
| DEPC eau traitée |
Volume de réaction: 5,5 ul
Remarque: la concentration finale des amorces tige-boucle devrait être 1-5 nM (ici 2 nM).
Préparer Master-Mix (volumes par réaction) comme suit:
| 1. DEPC eau | 1,959 ul |
| 2. 10x RT-Buffer | 0,55 ul |
| 3. Inhibiteur de RNase (40 U / pl) | 0,0715 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 0,275 ul |
| 5. x-Plex mélange d'amorces reverse tige-boucle (40 nM) * | 0,275 ul |
| 6. MMLV-RT (50 U / pl) | 0,369 ul |
- Mix et centrifuger brièvement.
- Ajouter 3,5 ul Master-Mix d'un échantillon de 2 pl.
- Procédez comme suit RT-réaction:
16 ° C pendant 30 minutes, suivie par 60 cycles à 20 ° C pendant 30 secondes, 42 ° C pendant 30 secondes, 50 ° C pendant 1 seconde et enfin 85 ° C pendant 5 minutes pour inactiver MMLV-RT, 4 ° C ∞ . - Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
* Liste des inverser tige-boucle amorces peuvent être trouvés au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Pré-amplification (pré-PCR)
(Suite à un protocole par Tang et al. 2 avec des modifications.)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # | Commentaires |
| dNTP (100 mM) | Applied Biosystems | 4368814 | Capsule haute. Kit archive ADNc. |
| 2x Universal PCR Master Mix avec NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-Plex mélange d'amorces vers l'avant (450 nm) * | Integrated DNA Technologies | Personnalisé | Séquences * |
| Universal amorce inverse (100 uM) | Integrated DNA Technologies | Personnalisé | Séquence 2 |
| Polymérase AmpliTaqGold (5 U / pl) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC eau traitée |
Volume de réaction: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-produit)
Remarque: pré-amplification est nécessaire pour améliorer la force du signal, en particulier lorsque la concentration de départ de l'ARN est limité. Le niveau d'entrée ARN détermine le nombre optimal de cycles de pré-PCR. Compte tenu de la même efficacité relative de chaque cycle de PCR devrait doubler la concentration du produit final. Comme certains miARN sera plus fortement exprimée, éviter la sur le cyclisme. Toutefois, la sous-amplification peut entraîner une perte de sensibilité de détection, notamment pour les microARN exprimé à des niveaux faibles. Dans nos mains 12 cycles d'amplification pré, en utilisant 100 ng d'ARN total, apparaissent suffisantes. En utilisant du sérum comme matériau de départ, 12 résultats des cycles de niveaux détectables miARN, mais 15 cycles semblait être supérieure. Enfin, à partir de 3 ovocytes (environ 400 pg d'ARN total par ovocyte 3), 16 pré-amplification des cycles succès nous a permis de dépister les niveaux d'expression de microARN 4.
* Liste des amorces sens peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Préparer Master-Mix (volumes par réaction) comme suit:
| 1. 2x universelle MM | 13,75 ul |
| 2. DEPC eau | 0,792 ul |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0,55 ul |
| 4. dNTP (100 mM) | 1,1 ul |
| 5. x-Plex mélange d'amorces vers l'avant (450 nm) | 3,06 ul |
| 6. Universal RP (100 uM) | 1,375 ul |
| 7. Polymérase AmpliTaqGold (5 U / pl) | 1,375 ul |
- Mélanger et centrifuger brièvement.
- Ajouter 22 ul Master-Mix à chaque 5,5 ul RT-produit.
- Effectuez les opérations suivantes pré-PCR:
95 ° C pendant 10 min, 55 ° C pendant 2 min, suivie par 10 à 18 cycles de 95 ° C pendant 1 s et 65 ° C pendant 1 min, 4 ° C ∞.
6. La purification du produit pré-PCR
Purification par sélection de la taille sur un gel de polyacrylamide natif de 10%
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # |
| 40% d'acrylamide / Bis Solution | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp échelle d'ADN | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Or gel d'acide nucléiques tache 10000 X concentrent dans le DMSO | Invitrogen | S11494 |
| Le glycogène (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Tampon-EB | ||
| Ammoniumpersulfate 10% (APS) | ||
| DIX-Buffer | ||
| 6x Orange G | ||
| DEPC eau traitée | ||
| ddH2O |
a. Préparation de gel
Pour faire 10ml d'un mélange de polyacrylamide à 10%, ajouter
| 1. ddH 2 O | 6,5 ml |
| 2. TBE 10x | 1 ml |
| 3. Polyacrylamide (40%) | 2,5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 ul |
| 5. TEMED | 4 pl |
- Préparer échelle d'ADN:
- 0,5 ul 10 échelle d'ADN pb
- 4,5 pi de tampon (EB)
- 1 pl 6x Orange G
- Ajouter 5,5 ul 6x Orange G à chaque 27,5 ul pré-PCR produit.
b. Exécuter Gel
- Exécuter Gel avec 150V pour 55-60 minutes.
Remarque: le bleu de bromophénol comme indicateur fonctionne avec la région 20 pb.
C. Gel Stain
- Tache de gel avec SYBR-Gold pour 25 minutes sur agitateur.
Remarque: SYBR-Gold est sensible à la lumière.
d. Couper Gel
- Découpez des bandes de produit pré-PCR de 60 à 80 pb et transfert à tube étiqueté.
Remarque: Une bande de faible ARN d'entrée pré-PCR des produits pourraient ne pas être visibles. - Crush bande de gel (tube de centrifugation par exemple dans le tube).
e. Re-extrait d'ADNc
- Ajouter 300 ul RTE-tampon et incuber à 37 ° C pendant 4 heures sur un agitateur.
- Transfert de fluides d'un tube de collecte étiquetés, ajouter un autre 300 ul RTE-tampon dans le tube de gel contenant et incuber le tout à 4 ° C pendant la nuit sur un agitateur.
- Aspirer le liquide restant, le transfert sur le tube de collection désignée comme avant et noter le volume total récupéré.
f. Précipitation à l'éthanol
- Ajouter 3 volumes d'éthanol à 100% la température ambiante.
- Ajouter 0,5 ul glycogène (20 mg / ml).
- Vortex.
- Incuber sur la glace sèche pendant au moins 2 heures ou à -80 ° C la nuit.
- De spin dans microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 30 minutes pour obtenir un culot d'ADNc.
- Dump de liquide, ajouter 700 ul température ambiante 75% d'éthanol et de spin pendant 10 minutes.
- Dump de liquide et de spin à nouveau pendant 5 minutes.
- Sucer surnageant sans déranger granulés et sécher à l'air pendant 10 minutes.
- Reprendre le culot dans de l'eau propre.
Remarque: le volume désiré de la solution concentrée d'ADNc est dépendante sur le design expérimental et devrait inclure des expériences de contrôle.
7. La purification du produit pré-PCR
Purification par digestion enzymatique des amorces suivi par la colonne de spin (suivant les protocoles fabrique)
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| Kit MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004 |
Remarque: Dans nos mains l'exclusivité enzymatique de nettoyage amorces supprimé avec succès, mais aussi conduit à une dégradation partielle du produit de pré-amplifiée, probablement en raison de dénaturation partielle des produits courte que la température monte jusqu'à 80 ° C pendant l'étape de l'inactivation du enzymatique. Eviter inactivation par la chaleur et directement purification des produits PCR de la réaction enzymatique utilisant colonnes de centrifugation élimine tout apprêt, sans dégradation du produit.
- Mélanger 5 ul post-PCR produit avec 2 ul ExoSAP-IT.
- Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes à se dégrader amorces restantes et les nucléotides.
- Ajouter 5 volumes de tampon PB pour 1 volume de la réaction PCR et mélanger, si j'ai indicateur de pH a été ajouté au tampon PB, vérifiez que la couleur du mélange est jaune.
- Placer une colonne dans une condition MinElute tube collecteur de 2 ml dans un rack approprié.
- Appliquez l'échantillon à la colonne MinElute et centrifuger pendant 1 minute.
- Jeter l'éluat, placer la colonne MinElute revenir dans le même tube et ajouter 750 pi de tampon PE à la colonne MinElute à laver et centrifuger pendant 1 minute.
- Jeter l'éluat et le lieu de la colonne de retour MinElute dans le même tube. Centrifuger la colonne pour un supplément de 1 minute à vitesse maximale.
- Placer la colonne dans un endroit propre MinElute 1,5 ml microtube.
- Pour éluer l'ADN, ajouter 10 ul d'eau DEPC traitées au centre de la membrane, laissez la colonne reposer pendant 1 minute, puis CENcentrifugeuse pendant 1 minute.
8. Fludigim 96,96 qRT PCR profilage
| Nom du réactif | Société | Prod / Cat # | Commentaires |
| Fluidigm 96,96 Kit Dynamic Array 96,96 tableau dynamique 96,96 fluides ligne de contrôle Réactif 20x Chargement | Fluidigm Corporation | ||
| Mélange de Amorce reverse universelle (1 pM) Amorce sens (1 pM) Sonde TaqMan (0,2 M) | Integrated DNA Technologies | Personnalisé | Séquence (1) |
| 2x Universal PCR Master Mix avec NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Amorçage de la SFI 96.96 Dynamic Array
- Injecter du liquide de ligne de commande (150 pl) dans chacun des accumulateurs sur la puce.
- Puce Placer dans la SFI (intégré fluidiques circuit) contrôleur et exécuter le premier (136x) script pour fluide de commande de ligne principale dans la puce.
Remarque: Chip doit être utilisé 24 heures après l'ouverture du paquet. Assurez-vous de ne pas renverser le liquide ligne de contrôle puisque le liquide de ligne de commande sur la puce ou dans les criques rend la puce inutilisable. Chip doit être chargé dans les 60 minutes de l'amorçage.
2. Préparation des échantillons
2.1 Pré-Préparation d'échantillons
Dans un tube en plastique jetables, mélanger les composants dans le tableau ci-dessous pour rendre l'échantillon-Pre-Mix (volumes par entrée).
| 2x TaqMan Universal Mix Master | 2,5 pi |
| Réactif 20x Chargement | 0,25 ul |
Remarque: Le volume final est de 2,75 ul, comme des excédents pour la pipette se dispenser des pertes
2.2 préparation des échantillons
Mélanger dans 96 puits de format de chaque échantillon avec un mélange de l'échantillon pré-(volumes par entrée).
| Pré-Sample-Mix | 2,75 ul |
| Exemple | 2,25 ul |
Remarque: Vortex et centrifuger brièvement plaque de 96 puits pour recueillir du liquide.
Volume final par entrée 5 pl, prendre en compte la perte de pipetage en préparant un volume légèrement plus élevé.
2.3 Préparation des dosages 13x
- Utiliser une plaque à 96 puits pour préparer des dosages 13x. 1x concentrations dans le tableau ci-dessous, l'échelle pour 13x.
| Universal Primer inverse | 1 um (1x) | Séquence à 2 |
| * Amorce sens | 1 um (1x) | * |
| Spécifiques du gène sonde TaqMan # | 0,2 um | # |
* Liste des amorces sens peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Liste des sondes TaqMan # peut être trouvé au http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- Mélanger dans une plaque de 96 nouveaux aliquotes ainsi des essais avec du Tween 13x pour une concentration finale de 0,25% de Tween
Remarque: Le volume final par l'entrée est de 5 pi, de préparer un volume suffisant (5,5 pi) de prendre la perte de volume pendant le transfert en compte. - Mélangez bien, en évitant les bulles et centrifuger brièvement pour ramasser fluide.
3. Chargement de la puce
Remarque: Afin de permettre le chargement correct des échantillons et les analyses assurer le positionnement correct de la puce. Il est commode d'aligner l'encoche dans le coin supérieur gauche.
S'assurer que tous les test et les solutions d'échantillon sont mélangés avant le chargement de la puce. Il est commode de le faire dans une plaque à 96 puits et spin bas de la plaque avant de charger la puce. Soyez conscient de la carte puce de pipetage pour référence ultérieure.
Entrées de l'échantillon non utilisés doivent être remplis avec 2,75 Mélanger l'échantillon d'eau et 2,25 ul ul ADN libre.
Entrées de dosage non utilisés doivent être remplis avec 2,5 réactif de dosage de chargement et de 2,5 ul d'eau ul.
Ne pas dépasser le premier arrêt lors du pipetage pour éviter d'introduire des bulles d'air.
- Après le chargement des échantillons et des essais (Volume par entrée: 5 pl) exécuter le script de chargement Mix (136x) script pour charger les échantillons et les analyses dans la puce.
- Après le script est terminé, retirez la puce du contrôleur ICF.
- Pelez la pellicule de protection bleue à partir du dessous de la puce chargée.
- Enlevez toutes les particules de poussière ou des débris de la surface de la puce.
4. 96,96 qRT-PCR
- Transfert de la puce au système BioMark et utiliser les conditions suivantes de l'amplification:
55 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 55 ° C pendant 1 min. - Suivre le protocole de fabrication pour la collecte de données du logiciel.
5. Utilisation du logiciel d'analyse qPCR
Après la RT-PCR du logiciel propriétaire fournit des courbes d'amplification, des cartes de chaleur et les valeurs de Ct pour chaque puits. S'il vous plaît se référer au manuel du logiciel pour l'analyse des données.
9. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Représentation schématique du flux de production expérimentale. Montré est une description étape par étape du multiplex qRT-PCR, y compris la purification (étape e) d'amorces excessive de la transcription inverse multiplex (étape C) et préamplification multiplex (étape D) avant détection en temps réel (étape f), résultant en un modèle purifiée d'ADNc pour qRT-PCR. FP: microARN amorces spécifiques de l'avant, URP: amorce reverse universel, R-SLP: microARN spécifiques inverse tige-boucle primaire.
Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. . Purification sur gel Polyacryamide du modèle qRT-PCR après pré-PCR bandes de la taille du produit pré-PCR sont exclusivement vu dans les échantillons de WT, mais pas dans microARN DGCR8 déficiente - / - ou Dicer - / - échantillons (flèches) après 96-plexe RT et 12 cycles de préamplification. Notez que des produits non spécifiques d'origine inconnue (flèches) et les amorces excessive se retrouvent dans tous les échantillons (étoiles).
Figure 3. Purification après préamplification multiplexe améliore grandement la précision des qRT-PCR a) Comparaison des niveaux d'expression relative de WT MESC d'Dgcr8 -. / - (MicroARN canoniques déficient) MESC révèle 1) la détection de plus de microARN et 2) la perte de faux positifs signaux dans Dgcr8 - / - après purification horizons loin amorces du produit pré-PCR. b) Après purification, les niveaux d'expression relative des deux DGCR8 - / - / WT et Dicer - / - / WT montrent une perte de faux signaux positifs et permettent de catégorisation appropriée des rares Dgcr8 indépendante / dépendante Dicer petits ARN (miR-320, - 484, -877) 5.
Figure 4. Fluidigm haut débit profilage miARN qRT-PCR. Exemple capture d'écran de 96,96 Fluidigm qRT PCR profilage mircoRNA à l'écran de modification des niveaux de miARN de sérums de la prostate malade du cancer. Le logiciel en temps réel qPCR analyse fournit des courbes d'amplification, des cartes thermiques de couleur et de cycle seuil (Ct).
Discussion
miARN sont courtes (18-24 nucléotides), non-codante miARN ARN qui régulent l'expression génique post-transcriptionnelle par les deux ARN messagers déstabilisant (ARNm) et en inhibant leur traduction. 6 Le fait qu'au moins un tiers des gènes humains contiennent conservé binding-sites dans leur 3'UTR et les interactions avec les miARN évident de gènes de pluripotence, la prolifération et l'apoptose suggère une contribution essentielle dans les décisions du destin cellulaire, l'homéostasie des tissus et des maladies comme le cancer. 6,7 conséquent précise des profils d'expression de microARN sont des grands intérêt.
Pour tester le multiplex publié qRT-PCR profilage miARN expression 2, nous avons utilisé des petits ARN MESC déficient comme témoins négatifs. DGCR8 - / - cellules sont déficientes de toutes les microARN canoniques, tandis que Dicer - / -. MicoRNAs cellules manquent tant canoniques et non canoncial 8,9
La comparaison des niveaux de type sauvage MES-à DGCR8 - / - cellules, nous avons découvert un manque de précision que plusieurs ont exprimé 10 microARN n'ont pas été détectés dans les cellules de type sauvage 11. Certains ont même montré des niveaux d'expression plus faible par rapport aux cellules KO (figure 3a). Nous avons supposé que le manque de précision pourrait être causé par l'amorce massifs report de deux étapes consécutives de multiplex (RT-PCR et pré) avant singleplex RT-quantification. Toutefois, multiplex de pré-amplification est nécessaire de renforcer la force du signal, en particulier lorsque la concentration de départ de l'ARN est limité. En purifiant l'écart des produits pré-PCR à partir des amorces par une sélection de taille sur des gels de polyacrylamide natif (figure 2), nous avons pu démontrer une amélioration substantielle de la précision en détectant plus de microARN et une perte de faux signaux positifs dans les deux Dgcr8 - / - et Dicer - / - milieux (figures 3a et 3b) En outre, le modifiés qRT PCR approche a permis pour la catégorisation appropriée des rares Dgcr8 indépendante / dépendante Dicer petits ARN (figure 3B) 11. Par conséquent, une étape supplémentaire pour purifier amorces excessive loin de pré-PCR produit est clairement avantageux, surtout quand en utilisant l'amorce multiplexe de grands ensembles par échantillon.
Le nombre optimal de pré-amplification des cycles est déterminée par les concentrations d'ARN d'entrée. Le solde de ne pas sous-ou overamplify devrait être guidé par des indications sur l'expérience spécifique.
Avec plus d'un millier de microARN connue, l'utilisation de la norme 384 puits ne peut être optimale pour le profilage de microARN longue, surtout quand on compare plusieurs échantillons. L'IFC de Fluidigm tableaux dynamiques permet, avec une diminution significative des étapes de pipetage et de la chimie nécessaire, des tests jusqu'à 96 échantillons individuels contre 96 microARN différents en une seule expérience (9216 réactions) à l'échelle du nanolitre (6,7 nL). Pour chaque exécution du logiciel d'analyse fournit les courbes d'amplification, des cartes thermiques de couleur et les valeurs seuils de cycle (Ct). Le simultanées à grande échelle de profilage réduit les variances expérimentales et permet pour la normalisation expression de valeur moyenne, ce qui surpasse les autres stratégies de normalisation qui utilisent des contrôles petit ARN. 12
Comparé à 384 plates-formes disponibles dans le commerce bien avec des sondes TaqMan pré-attribué, la combinaison d'une plateforme de profilage à haut débit avec des ensembles d'amorces sur-mesure offre une grande flexibilité expérimentale.
Le multiplex optimisé qRT PCR démarche en combinaison avec la plateforme Dynamic Array succès nous a permis de cribler simultanément 48 sérums de patients cancer de la prostate pour les altérations des niveaux de 384 miARN (Figure 4) et pour normaliser les données, sans pic de commandes (ie synthétiques microARN). 11
Malgré la hausse des étapes de la préparation des échantillons à des résultats de profilage, l'approche décrite est un temps et rentable méthode à haut débit fixe au profil large échantillon pour des niveaux d'expression des miRNA, même avec du matériel de départ limité.
Disclosures
Alan Mir est un employé de Fluidigm Corporation. Sinon, nous n'avons pas d'intérêts financiers à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le laboratoire Blelloch pour commenter le texte. Ce travail a été soutenu par des fonds à partir de RB NIH (K08 NS48118 et R01 NS057221), du California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Subvention de démarrage RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) et le Pew Charitable Trust et à la bande FM de la Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
