Summary
Här beskriver vi ett optimerat multiplex omvänt transkriptas kvantitativ PCR (QRT-PCR) protokollet i kombination med en mikroflödessystem plattform som ett kostnadseffektivt och tidsbesparande high-throughput screening verktyg för mikro-RNA (miRNA) uttryck nivå, särskilt när man arbetar med begränsade mängder av prov.
Abstract
Ett brett deltagande av miRNA i kritiska processer som ligger bakom utvecklingen, mjukpapper homeostas och sjukdom har lett till en svallande intresse bland forskning och läkemedelsutveckling samhällen. Att studera miRNA, är det viktigt att kvantifiering av mikroRNA nivåer är exakt och slitstark. Genom att jämföra vildtyp till små RNA bristfälliga musen embryonala stamceller (Mesc) visade vi en brist på noggrannhet och robusthet i tidigare publicerade multiplex QRT-PCR-tekniker. Här beskriver vi en optimerad metod, inklusive rena bort alltför primer från tidigare multiplex steg innan singleplex realtid upptäckt, vilket dramatiskt ökar noggrannheten och robusthet av tekniken. Vidare förklarar vi hur du utför tekniken på ett mikroflödessystem chip på metod i nanoliter volymer minskar reagens kostnader och möjliggör mycket effektiv med hög genomströmning profilering miRNA uttryck.
Protocol
1. RNA-extraktion: celler som odlas i monolager
(Enligt tillverkarens protokollet använder TRIzol.)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # |
| TRIzol Lösning | Invitrogen | 15596-018 |
| Isopropylalkohol | Sigma-Aldrich | 1907-64 |
| Kloroform | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Etanol | ||
| RNAse fritt vatten |
Homogenisering
- Homogenisera celler direkt på kulturen maträtt genom att tillsätta 1 ml Trizol lösning per 10 cm 2 fat område, snurra Trizol runt och pipett upp och ner för att säkerställa full täckning av plattan.
Fasseparation
- Inkubera homogeniserade provet i 5 minuter i rumstemperatur.
- Överför i ett märkt rör, tillsätt 0,2 ml kloroform per 1ml TrizolSolution och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder.
- Inkubera vid rumstemperatur i 3 minuter.
- Centrifugera provet vid 12.000 xg under 15 minuter vid 2 ° C. Efter centrifugering blandningen separerar i en lägre röd fas, en interfas och en färglös övre vattenfasen, som innehåller RNA och bör vara 60% av den totala Trizol Solution volym.
RNA Nederbörd
- Överför vattenfasen, RNA som innehåller fasen till ett nytt märkt, rör.
- Fällning RNA genom att tillsätta 0,5 ml isopropylalkohol per 1 ml Trizol Solution.
- Inkubera proverna i rumstemperatur i 10 minuter.
- Centrifugera vid 12.000 xgi 10 minuter vid 2 ° C.
RNA-tvätt
- Efter centrifugering, kasta supernatanten från rören.
- Tvätta RNA pellet (på sidan och botten av röret) genom att lägga minst 1 ml 75% etanol per 1 ml Trizol Solution, virvel.
- Centrifugera vid 7500 xgi 5 minuter vid 2 ° C.
RNA Elution
- Kasta bort vätskefasen och centrifugera igen i 1 minut. Ta bort överdriven vätska.
- Lufttorka pellets i 5-10 minuter.
OBS: över torkade RNA är svårt att löses. - Lös pelleten i RNas fritt vatten genom att pipettera lösningen upp och ner och inkubera i 10 minuter vid 55 ° C.
- Mät RNA-koncentration (A260/280 ratio) med hjälp av en Nanodrop ™ spektrofotometer.
- Förvaras vid -80 ° C tills redo att användas.
2. RNA-extraktion: Serum
(Till följd Mirvana PARIS Kit tillverkarens protokollet modifieras av Mitchell et al. 1)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # | Kommentarer |
| mir Vana PARIS Kit 2X Denaturering Lösning Syra-Fenol: Kloroform miRNA Tvättlösning 1 miRNA Tvättlösning 2 / 3 | Ambion | AM1556 | Ändrad protokoll |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Etanol | |||
| DEPC behandlat vatten |
Kemiskt preparat:
- Tillsätt 375 l av 2-merkaptoetanol till 2X Denaturering lösningen och blanda väl.
- Tillsätt 21 ml 100% etanol till de miRNA tvättlösning 1.
- Tillsätt 40 ml 100% etanol till de miRNA tvättlösning 2 / 3.
Provberedning:
- Tina serumprov på is.
Homogenisering
- Blanda 300 l provet med en lika stor volym (300 l) av 2X Denaturering Solution (bör vara vid rumstemperatur) och skaka.
- Inkubera blandningen på is i 5 minuter.
- Lägg till en volym av syra Fenol: Kloroform lika med den totala volym av provet lysat plus 2X Denaturering Solution (600 l).
Viktigt: Använd INTE vatten buffert som ligger på toppen av syra Fenol: kloroform. - Vortexa blandningen i 60 sekunder.
- Centrifugera vid rumstemperatur i 15 minuter vid maximal hastighet (> 10,000 xg). Efter centrifugering blandningen separerar i en övre vattenfasen, en interfas och en lägre organisk fas.
- Ta bort vattenfasenOU lager ovanpå (ska vara 300 till 500 l inklusive proteinacious "dimmig" lager).
- Packa vattenskiktet som tidigare genom att återigen lägga kloroform.
Viktigt: vattenskiktet i andra extraktionen rutinmässigt mindre i volym (250 l). Notera volymen återhämtat sig.
Beredning av slutliga RNA-isolering (totalt RNA)
- Pre-värme (95 ° C) nukleasfritt vatten.
- 100% etanol måste vara vid rumstemperatur.
Slutlig RNA-isolering (totalt RNA)
- Tillsätt 1,25 volymer av 100% etanol till de återvunna vattenfasen (t.ex. om 300 l återfanns, tillsätt 375 l etanol) och blanda väl.
- För varje prov, placera en filterpatronen i en av samlingen rören.
- Pipettera lysat på filtret.
- Centrifugera (10.000 xg) i 30 sekunder, kasta genomströmning, Centrifugera igen i 30 sekunder och byt ut filterpatronen i samma provröret.
RNA-Wash
- Applicera 700 l Lösning miRNA Tvätta 1 till filtret och centrifugera i 15 sekunder, kasta genomströmning från insamling röret, och byt ut filterpatronen i samma provröret.
- Applicera 500 l Lösning miRNA Tvätta 2 / 3, Centrifugera i 15 sekunder, kasta genomströmning och upprepa med en andra 500 l tvättlösning 2 / 3.
- Kassera genomströmning och torr-spin i 1-2 minuter.
- Placera filtret i en ny samling rör, gäller 100 l RNAse fritt vatten (95 ° C), stäng locket och inkubera i 2 minuter.
- Centrifugera i ~ 2 minuter att återvinna RNA.
- Förvaras vid -80 ° C fram till användning.
3. Koncentration av RNA-lösning (5X)
(Till följd av tillverkning s protokoll)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # |
| MICROCON Centrifugal Filterskydd, UltraCell YM-3 | Millipore | 42.404 |
| DEPC behandlat vatten |
Enhet: Microcon UltraCell YM-3, Cutoff SS och DS Nukleotider: 10
Volym: Önskad volym åter koncentrerad RNA-lösning är beroende av experimentell design och omfatta kontroll experiment.
- Sätt reservoar Microcon provet i flaskan och pipettera lösningen i reservoaren.
OBS: Rör inte membranet. - Centrifugera i 185 minuter vid 4 ° C med maximalt 14.000 x g.
Obs: Placera injektionsflaska med spricka bandet mot rotorn. - Pipettera önskad volym av RNAse fritt vatten (t.ex. 20 l) på behållaren, placera reservoar inverterad in i en ny flaska och snurra i 3 minuter vid 4 ° C med maximalt 3000 x g.
- Förvaras vid -80 ° C fram till användning.
4. Omvänd transkription
(Efter ett protokoll av Tang et al. 2 med ändringar.)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # | Kommentarer |
| Hög kapacitet cDNA arkiv kit 10x cDNA arkivering buffert dNTP (100 mm) Moloney murina leukemi virus (MMLV) omvänt transkriptas (50 U / l) | Applied Biosystems | 4368814 | ändrade protokollet |
| RNaseOUT (40 U / l) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-Plex omvänd stam-loop primermix (40 nM) * | Integrerad DNA-teknik | Anpassad | Sekvenser * |
| DEPC behandlat vatten |
Reaktion Volym: 5,5 l
Obs: den slutliga koncentrationen av Stem-slingan primer bör 1-5 nM (här 2 nm).
Förbered Master-Mix (volymer per reaktion) enligt följande:
| 1. DEPC-Vatten | 1,959 l |
| 2. 10x RT-buffert | 0,55 l |
| 3. RNas hämmare (40 U / l) | 0,0715 l |
| 4. dNTP (100 mm) | 0,275 l |
| 5. x-Plex omvänd stam-loop primermix (40 nM) * | 0,275 l |
| 6. MMLV-RT (50 U / l) | 0,369 l |
- Mix och centrifugera en kort stund.
- Tillsätt 3,5 l Master-Mix 2 l prov.
- Utför följande RT-reaktion:
16 ° C i 30 minuter, följt av 60 cykler vid 20 ° C i 30 sekunder, 42 ° C i 30 sekunder, 50 ° C i 1 sekund och till sist 85 ° C i 5 minuter för att inaktivera MMLV-RT, 4 ° C ∞ . - Förvara vid -20 ° C fram till användning.
* Lista över omvänd stam-loop primer finns på http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Pre-amplifiering (Pre-PCR)
(Efter ett protokoll av Tang et al. 2 med ändringar.)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # | Kommentarer |
| dNTP (100 mm) | Applied Biosystems | 4368814 | Hög mössa. cDNA arkiv Kit. |
| 2x Universal PCR Master Mix med NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-Plex framåt primermix (450 nM) * | Integrerad DNA-teknik | Anpassad | Sekvenser * |
| Universal Omvänd Primer (100 M) | Integrerad DNA-teknik | Anpassad | Sekvens 2 |
| AmpliTaqGold polymeras (5 U / l) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC behandlat vatten |
Reaktion Volym: 27.5μl (22μl mm + 5.5μl RT-produkt)
OBS: Pre-amplifiering är nödvändigt att förstärka signalstyrka, speciellt när man startar koncentrationen av RNA är begränsad. Ingången RNA bestämmer det optimala antalet Pre-PCR-cykler. Med samma relativa effektivitet varje PCR-cykel ska dubbla koncentrationen av slutprodukten. Eftersom vissa miRNA kommer att bli mer hög grad uttryckt undvika över cykling. Däremot kan under-förstärkning resultera i en förlust av känslighet, särskilt för mikroRNA uttrycks på låga nivåer. I våra händer 12 före amplifiering cykler, med 100 ng av det totala RNA, verkar tillräckliga. Använda serum som utgångsmaterial, 12 cykler resulterar i detekterbara miRNA nivåer, men 15 cykler verkade vara överlägsen. Slutligen tillåts från och med 3 ägg (cirka 400 pg totala RNA per äggcellen 3), 16 pre-amplifiering cykler framgångsrikt oss att skärmen nivåer mikroRNA uttryck 4.
* Lista över framåt primer finns på http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Förbered Master-Mix (volymer per reaktion) enligt följande:
| 1. 2x Universal MM | 13,75 l |
| 2. DEPC-Vatten | 0,792 l |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0,55 l |
| 4. dNTP (100 mm) | 1,1 l |
| 5. x-Plex framåt primermix (450 nM) | 3,06 l |
| 6. Universal RP (100 M) | 1,375 l |
| 7. AmpliTaqGold polymeras (5 U / l) | 1,375 l |
- Blanda och centrifugera en kort stund.
- Tillsätt 22 l Master-Mix till varje 5,5 l RT-produkt.
- Utför följande Pre-PCR-reaktionen:
95 ° C i 10 min, 55 ° C under 2 min, följt av 10 till 18 cykler av 95 ° C i 1 s och 65 ° C under 1 min, 4 ° C ∞.
6. Rening av Pre-PCR-produkten
Rening genom storlek urval på en 10% infödda polyakrylamidgel
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # |
| 40% akrylamid / BIS-lösning | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp DNA stege | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Guld nukleinsyra gel fläcken 10,000 x koncentrera DMSO | Invitrogen | S11494 |
| Glykogen (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Buffert-EB | ||
| 10% Ammoniumpersulfate (APS) | ||
| TEN-buffert | ||
| 6x Orange G | ||
| DEPC behandlat vatten | ||
| ddH2O |
A. Gel Förberedelser
För att 10ml av en 10% polyakrylamid blandning lägga till
| 1. DDH 2 O | 6,5 ml |
| 2. 10x TBE | 1 ml |
| 3. Polyakrylamid (40%) | 2,5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 l |
| 5. TEMED | 4 l |
- Förbered DNA stege:
- 0,5 l 10 bp DNA stege
- 4,5 l Buffer (EB)
- 1 l 6x Orange G
- Tillsätt 5,5 l 6x Orange G till varje 27,5 l Pre-PCR-produkt.
b. Kör Gel
- Kör Gel med 150V i 55-60 minuter.
Obs: Bromfenolblått som indikator körs med 20bp regionen.
C. Stain Gel
- Stain gel med SYBR-guld för 25 minuter på shaker.
Notera: SYBR-Guld är ljuskänsligt.
D. Klipp Gel
- Klipp ut Pre-PCR-produkt band från 60 till 80 räntepunkter och transfer till märkt rör.
Obs: Ett band för låg RNA ingång Pre-PCR-produkter kanske inte är synliga. - Crush gel band (t.ex. rör i rör centrifugering).
e. Packa cDNA
- Tillsätt 300 l TEN-buffert och inkubera vid 37 ° C i 4 timmar på en rotator.
- Överför vätskan till ett märkt provrör, lägga till ytterligare 300 l TEN-buffert för gelen som innehåller rör och inkubera alla vid 4 ° C över natten på en rotator.
- Aspirera återstående vätska, överföring till de märkta provröret som tidigare och notera den totala återvunna volymen.
F. Etanol Nederbörd
- Tillsätt 3 volymer av rumstemperatur 100% etanol.
- Tillsätt 0,5 l Glykogen (20 mg / ml).
- Vortex.
- Inkubera på torris i minst 2 timmar eller vid -80 ° C över natten.
- Spin i mikrocentrifug vid 4 ° C i 30 minuter till pellets cDNA.
- Dumpa vätska, tillsätt 700 l rumstemperatur 75% etanol och centrifugera i 10 minuter.
- Dumpa vätska och snurra igen i 5 minuter.
- Sug bort supernatanten utan att störa pelleten och lufttorka i 10 minuter.
- Lös pelleten i rent vatten.
OBS: önskad volym av koncentrerad cDNA lösning är beroende av experimentell design och omfatta kontroll experiment.
7. Rening av Pre-PCR-produkten
Rening genom enzymatisk nedbrytning av primer följt av centrifugering kolumn (efter tillverkar protokoll)
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78.250 |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28.004 |
Obs: I våra händer den exklusiva enzymatisk sanering tagits bort grundfärger, men också lett till partiell nedbrytning av pre-förstärkta produkt, möjligen på grund av partiell denaturering av den korta produkterna som temperaturen stiger upp till 80 ° C under inaktivering steg i enzym. Undvika värmeinaktivering och direkt rena PCR-produkter från den enzymatiska reaktionen med hjälp av spin kolonner tar bort alla grundfärg utan att produkten försämras.
- Blanda 5 l post-PCR-produkten med 2 l ExoSAP-IT.
- Inkubera vid 37 ° C i 15 minuter för att förnedra återstående primers och nukleotider.
- Tillsätt 5 volymer av Buffer PB till en volym av PCR-reaktionen och blanda om pH-indikator jag har lagts till Buffert PB, kontrollera att färgen på blandningen är gul.
- Placera en MinElute kolumn i en förutsättning 2 ml provrör i en lämplig rack.
- Applicera provet till MinElute kolonnen och centrifugera i 1 minut.
- Kasta genomströmning, placera MinElute kolumnen tillbaka in i samma rör och tillsätt 750 l Buffer PE till MinElute kolumnen att tvätta och centrifugera i 1 minut.
- Kasta genomströmning och placera MinElute kolumnen tillbaka i samma rör. Centrifugera kolumnen för ytterligare 1 minut vid maximal hastighet.
- Placera MinElute kolonnen i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- För att eluera DNA, tillsätt 10 l DEPC renat vatten till mitten av membranet, låt kolumnen stå i 1 minut och sedan CENtrifuge i 1 minut.
8. Fludigim 96,96 QRT-PCR Profilering
| Reagensets namn | Företag | Prod / Katt # | Kommentarer |
| Fluidigm 96,96 Dynamic Array Kit 96,96 dynamisk array 96,96 kontrollinje vätska 20x Laddar Reagens | Fluidigm Corporation | ||
| Mix av Universal Omvänd Primer (1 M) Framåt Primer (1 M) TaqMan Probe (0,2 M) | Integrerad DNA-teknik | Anpassad | Sequence (1) |
| 2x Universal PCR Master Mix med NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Kontroll av 96,96 Dynamic Array IFC
- Injicera vätskan kontrollinje (150 l) i vart och ett av ackumulatorer på chipet.
- Placera marker i IFC (integrerade fluidic krets) controller och kör Prime (136x) skript för bästa kontroll linje vätska in chipet.
Obs: Chip behöver användas 24 timmar efter att ha öppnat paketet. Se till att du inte spiller vätska kontrollinjen sedan kontrollinjen vätska på chippet eller i vikarna gör chip oanvändbar. Chip behöver laddas inom 60 minuter efter grundningen.
2. Förbereda prover
2,1 Pre-Provberedning
I en disponibel plaströr, kombinera de komponenter i tabellen nedan för att göra prov-Pre-Mix (volymer per inlopp).
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2,5 l |
| 20x Laddar Reagens | 0,25 l |
Obs: Final Volymen är 2,75 l, som översatsning för pipett avstå förluster
2,2 Prov-förberedelse
Kombinera i 96 brunnar varje prov med tidigare prov mix (volymer per inlopp).
| Pre-Sample-Mix | 2,75 l |
| Exempel på | 2,25 l |
Obs: Vortex och centrifugera 96 brunnar kort att samla vätska.
Slutlig Volym per inlopp 5 l, ta pipettering förlust hänsyn genom att förbereda något högre volym.
2,3 Förbereda 13x analyser
- Använd en 96 brunnar för att förbereda 13x analyser. 1x koncentrationer i tabellen nedan, skala upp till 13x.
| Universal Omvänd Primer | 1 mikrometer (1x) | Sekvens i två |
| Framåt Primer * | 1 mikrometer (1x) | * |
| Genspecifika TaqMan probe # | 0,2 ìm | # |
* Lista över framåt primer finns på http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
# Förteckning över TaqMan-prober finns på http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- Kombinera i en ny 96 brunnar alikvoter av 13x försök med Tween för en 0,25% sista Tween koncentration
OBS: Final volym per inlopp är 5 l, förbereda tillräcklig volym (5,5 l) för att ta förluster under volym överlåtelsen beaktats. - Blanda väl och undvika bubblor och centrifugera en kort stund för att samla vätska.
3. Fylla på chips
OBS: För att möjliggöra för korrekt laddning av prover och analyser säkerställa en korrekt placering av chip. Det är bekvämt att anpassa snäpp till det övre vänstra hörnet.
Se till att alla test och prov lösningarna blandas innan du lägger chipet. Det är bekvämt att göra detta på en 96 brunnar och snurra plattan ner innan du lägger chipet. Var medveten om chip pipettering kartan för senare användning.
Oanvända prov Intagen bör fyllas med 2,75 l prov Blanda och 2,25 l DNA-fritt vatten.
Oanvända analys Intagen bör fyllas med 2,5 l-analysen lastning reagens och 2,5 l vatten.
Gå inte förbi det första stoppet medan pipettering för att undvika att införa luftbubblor.
- Efter lastning prover och analyser (VOLYM per inlopp: 5 l) kör Ladda Mix manus (136x) skript för att ladda prover och analyser i chipet.
- Efter att skriptet är klar, ta bort chipet från ICF styrenheten.
- Dra den blå skyddsfilmen från undersidan av den laddade chip.
- Ta bort eventuella partiklar eller skräp från chipet ytan.
4. 96,96 QRT-PCR
- Överför chip till BioMark systemet och använda följande förstärkningen villkor:
55 ° C under 2 min, 95 ° C i 10 min, följt av 40 cykler på 95 ° C i 15 S och 55 ° C i 1 min. - Följ tillverkares protokoll för insamling av uppgifter programvara.
5. Använda qPCR analysprogram
Efter att RT-PCR för proprietär programvara ger förstärkning kurvor, kartor värme och Ct-värden för varje brunn. Se programmet manualen för dataanalys.
9. Representativa resultat:
Figur 1. Schematisk representation av experimentella arbetsflödet. Visas är en steg-för-steg-beskrivning av multiplex QRT-PCR-protokoll, inklusive rening (steg E) av överdriven primer från multiplex omvänd transkription (steg C) och multiplex Förförstärkning (steg D) innan realtid upptäckt (Steg F), vilket resulterar i renad cDNA mall för QRT-PCR. FP: mikroRNA specifika framåt primer, URP: allmän omvänd primer, R-SLP: mikroRNA specifika omvänd stam-loop primer.
Klicka här för en större bild.
Figur 2. . Polyacryamide gel rening av QRT-PCR mall efter förbehandling PCR-Band av pre-PCR-produkt storlek uteslutande ses i WT prover, men inte i mikroRNA brist DGCR8 - / - eller Dicer - / - prov (pilar) efter 96-Plex RT och 12 cykler av Förförstärkning. Observera att icke-specifika produkter av okänt ursprung (pilspetsar) och överdriven grundfärg finns i alla prover (stjärnor).
Figur 3. Rening efter multiplex Förförstärkning kraftigt förbättrar noggrannheten hos QRT-PCR-resultat a) Jämförelse av relativa uttryck nivåer av WT Mesc till Dgcr8 -. / - (Kanoniska mikroRNA bristfällig) Mesc avslöjar 1) upptäckt av fler mikroRNA och 2) förlust av falskt positiva signaler i Dgcr8 - / - bakgrunder efter rena bort primer för pre-PCR-produkten. b) Efter reningen relativa uttryck halter av både DGCR8 - / - / WT och Dicer - / - / WT visar en förlust på falskt positiva signaler och möjliggör korrekt kategorisering av sällsynta Dgcr8 oberoende / Dicer beroende små RNA (MIR-320, - 484, -877) 5.
Figur 4. Fluidigm hög genomströmning QRT-PCR miRNA profilering. Exempel skärmdump av 96,96 Fluidigm QRT-PCR mircoRNA profilering för att screena för förändringar i miRNA nivåer av prostatacancer patientens serum. I realtid qPCR analysprogram ger förstärkning kurvor, färgkodade kartor värme och cykel tröskeln (Ct).
Discussion
miRNA är korta (18-24 nukleotider), icke-kodande RNA, som reglerar genuttryck efter transkriptionellt av både destabiliserande budbärar-RNA (mRNA) och som försvårar deras översättning. 6 Det faktum att minst en tredjedel av mänskliga gener innehåller bevaras miRNA bindande-platser i sina 3'UTR och den uppenbara interaktioner miRNA med gener för pluripotens, spridning och apoptos föreslår ett avgörande bidrag i beslut cell öde, vävnad homeostas och sjukdomar som cancer. 6,7 därför noggrann mikroRNA uttryck profiler är av bred intresse.
För att testa de publicerade multiplex QRT-PCR miRNA expression profiling protokoll 2 använde vi små RNA bristfällig Mesc som negativa kontroller. DGCR8 - / - celler är brist på alla kanoniska mikroRNA, medan Dicer - / -. Celler som saknar både kanoniska och icke-canoncial micoRNAs 8,9
Jämföra nivåer i vild typ MES-to DGCR8 - / - celler, upptäckte vi en brist på precision som flera uttryckte 10 mikroRNA inte registreras i den vildtyp celler 11. Vissa visade ännu lägre uttryck nivåer i förhållande till knockout celler (Figur 3a). Vi antar att bristen på exakthet kan orsakas av den massiva primer föra över de två på varandra följande multiplex steg (RT och Pre-PCR) innan singleplex RT-kvantifiering. Dock är multiplex pre-amplifiering nödvändigt att förstärka signalstyrka, speciellt när man startar koncentrationen av RNA är begränsad. Genom att rena bort pre-PCR-produkter från primers efter storlek urval på inhemska polyakrylamidgeler (figur 2), kunde vi påvisa en väsentlig förbättring av exakthet genom att upptäcka mer mikroRNA och en förlust av falskt positiva signaler i både Dgcr8 - / - och Dicer - / - bakgrunder (figur 3a och 3b) Förutom den modifierade QRT-PCR-metoden tillåts för korrekt kategorisering av sällsynta Dgcr8 oberoende / Dicer beroende små RNA (Figur 3b) 11. Därför är ytterligare ett steg för att rena stora grundfärger bort från pre-PCR-produkten är naturligtvis positivt, speciellt när man använder stora multiplex primer set per prov.
Det optimala antalet pre-amplifiering cykler bestäms av indata RNA koncentrationer. Balansen att inte under-eller overamplify bör vägledas av uppgifter om den specifika experimentet.
Med mer än tusen kända mikroRNA, användning av standardkomponenter 384-brunnars plattor kanske inte optimalt för omfattande mikroRNA profilering, speciellt när man jämför flera prover. Den Fluidigm Dynamic Array IFC ger, med en betydande minskning av pipetteringssteg och behövde kemi, testning upp till 96 individuella prov mot 96 olika mikroRNA i ett enda experiment (9216 reaktioner) på metod i nanoliter skala (6,7 NL). För varje körning analys programvara ger förstärkning kurvor, färgkodade kartor värme och cykel gränsvärden (Ct). Den samtidiga stora profilering minskar experimentell varianser och tillåter betyder uttryck värde normaliseringsprocess som utklassar andra normalisering strategier som använder sig av små RNA kontroller. 12
Jämfört med kommersiellt tillgängliga 384 och plattformar med i förväg utsedda TaqMan-prober, erbjuder en kombination av en hög genomströmning profilering plattform med skräddarsydda primer ställer höga experimentella flexibilitet.
Den optimerade multiplex QRT-PCR metod i kombination med Dynamic Array-plattformen får framgång för oss att samtidigt skärm 48 prostata sera cancerpatient för förändringar i nivåer av 384 miRNA (Figur 4) och för att normalisera data utan topp i kontroller (dvs. syntetiska mikroRNA). 11
Trots ökningen av steg från prover förberedelse till profilering resultat är den beskrivna metoden en tids-och kostnadseffektivt med hög genomströmning metod för att profilera stora urval satser för nivåer miRNA uttryck, även med begränsad utgångsmaterial.
Disclosures
Alan Mir är anställd av Fluidigm Corporation. Annars har vi inga ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Blelloch lab för kommentera texten. Detta arbete stöddes av medel till RB från NIH (K08 NS48118 och R01 NS057221), California Institute of regenerativ medicin (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, Nya fakulteten Award RN2-00.906) och Pew Charitable Trust och på FM från Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
