Summary
在这里，我们描述一个优化的多重逆转录定量PCR（QRT - PCR）结合起来作为一个时间和成本效益高通量的microRNA（miRNA）的表达水平的筛检工具的微流体平台的协议，尤其是当样本数量有限的工作。
Abstract
在底层开发，组织homoeostasis和疾病的关键进程的miRNA广泛参与，导致之间涌动的研究和制药界的兴趣。要研究的miRNA，它是必不可少的microRNA水平的量化准确，稳健的。通过比较野生型的小分子RNA的缺陷小鼠胚胎干细胞（MESC），我们揭示了在先前公布的多重定量RT - PCR技术的准确性和鲁棒性的缺乏。在这里，我们描述了一个优化的方法，包括净化远离以前的多重步骤之前单一的实时检测，大大提高了该技术的准确性和鲁棒性的过度引物。此外，我们将解释如何执行一个微流体芯片在纳升量的技术，大大降低试剂成本，并允许时间有效的高通量的miRNA表达谱。
Protocol
1。 RNA的提取：在单层细胞培育出
（按照制造商的协议，用TRIzol。）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ |
| TRIZOL解决方案 | Invitrogen公司 | 15596-018 |
| 异丙醇 | Sigma - Aldrich公司 | 1907年至1964年 |
| 氯仿 | Sigma - Aldrich公司 | 彗星2432 |
| 乙醇 | ||
| 核糖核酸酶自由水 |
同质化
- 均质直接在培养皿中的细胞，加入1毫升Trizol法解决方案，每10厘米的2盘面积，漩涡周围的Trizol法和吸管向上和向下的钢板，以确保全覆盖。
相分离
- 孵育匀浆样品在室温下5分钟。
- 转移到一个标记管，加0.2毫升氯仿制成每1ml TrizolSolution管用手大力摇晃15秒。
- 在室温下孵育3分钟。
- 样品离心15分钟，在12000 XG 2 ° C。离心后的混合物分离成一个较低的相冲，一个相间和无色的上层水相，其中包含的RNA和总的Trizol溶液的体积应为60％。
RNA沉淀
- 转让的水，含有RNA的阶段到一个新的，标记管。
- 每1毫升的Trizol溶液中加入0.5毫升异丙醇沉淀的RNA。
- 样品在室温下孵育10分钟。
- 2 ° C。离心10分钟，在12000 XG
RNA洗
- 离心后，弃管的上清液。
- 加入至少1毫升75％，每1毫升的Trizol溶液，涡旋乙醇洗涤RNA的颗粒（侧面和底部的管）。
- 2 ° C。离心5分钟，在7500 XG
RNA的洗脱
- 弃上清，再次离心1分钟。卸下过多的液体。
- 空气干燥颗粒为5-10分钟。
注：以上干RNA是难以溶解。 - 在核糖核酸酶自由水溶解沉淀吹打的解决方案和下孵育10分钟，在55 ° C。
- 测量RNA的浓度（A260/280的比值）使用Nanodrop™分光光度计。
- 储存在-80 ° C，直到准备使用。
2。 RNA的提取：血清
（以下mirVana巴黎工具包制造商的协议修改米切尔等。 ）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ | 评论 |
| MIR瓦纳巴黎套件 2X变性解决方案 酸酚：氯仿 miRNA的清洗解决方案1 miRNA洗涤液的2 / 3 | Ambion公司 | AM1556 | 修改协议 |
| 2 - 巯基乙醇 | Sigma - Aldrich公司 | M7522 | |
| 乙醇 | |||
| DEPC处理水 |
化学制备：
- 2 - 巯基乙醇的加入375μL2X变性液，拌匀。
- 21毫升100％的乙醇添加到miRNA的洗涤液1。
- 100％的乙醇添加40毫升的miRNA洗涤液的2 / 3。
样品制备：
- 在冰上解冻血清样本。
同质化
- 混合2X变性液等体积（300μL）（应在室温下）和旋涡300μL的样品。
- 孵育5分钟，冰的混合物。
- 添加量的酸酚：氯仿等于样品裂解液加2X变性液（600μL）的总体积。
重要提示：不要使用缓冲溶液在于顶部的酸酚：氯仿。 - 旋涡混合60秒。
- 在室温下离心15分钟最大转速（> 10,000 XG）。离心后，上层水相，相间和较低的有机相的混合物分离成。
- 删除aque类层之上（300 - 500μL，包括任何proteinacious的“朦胧”层）。
- 像以前一样重新提取水层，再加入氯仿。
重要信息：第二次提取的水层是常规体积小（250μL） 。注意卷的恢复。
终审RNA隔离（总RNA的制备）
- 预热（95℃）无核酸酶水。
- 100％的乙醇必须在室温下。
最后RNA隔离（总RNA）
- 1.25卷100％的乙醇添加到回收的水相（例如，如果被收回300μL，加入375μL乙醇），调匀。
- 对于每个样本，放入收集管中的一个滤芯。
- 滴入的过滤器在裂解。
- 离心机（10,000 XG），30秒，丢弃流过，再次离心30秒到同一个收集管和更换滤芯。
RNA洗
- 应用700μLmiRNA的清洗液1滤芯和离心15秒，丢弃收集管流过，并更换成相同的收集管滤芯。
- 申请为15秒500μL的miRNA洗涤液的2 / 3，离心，丢弃的流量通过，并重复第二个500μL洗涤液的2 / 3。
- 弃掉1-2分钟流过干自旋。
- 放置在一个新的收集管滤芯，适用于100μL核糖核酸酶自由水（95℃），接近第2分钟孵化。
- 离心1〜2分钟恢复的RNA。
- 贮存于-80℃直至使用。
3。浓度RNA解决方案（5X）
（以下制造商的协议）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ |
| 单片机离心式过滤装置，Ultracell YM - 3 | Millipore公司 | 42404 |
| DEPC处理水 |
设备：单片机Ultracell YM - 3，截止SS和DS核苷酸：10
体积：所需的重新集中RNA溶液的体积是依赖于实验设计，并应包括对照实验。
- 插入小瓶单片机样品水库和水库移液器解决方案。
注：请勿触摸膜。 - 185分钟离心机在4 °最大14000 C X G.
注：位置对转子与打击乐队的小瓶。 - 移液器核糖核酸酶自由水所需的量（如20μL）上水库，水库的地方倒到一个新的瓶和3分钟旋转4 ° C最大3000小工
- 贮存于-80℃直至使用。
4。反转录
（由唐等协议。进行了修改。）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ | 评论 |
| 高容量的cDNA归档套件 10倍的cDNA归档缓冲区 的dNTP（100毫米） 莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV） 逆转录酶（50 U /μL） | 美国应用生物系统公司 | 4368814 | 修改协议 |
| RNaseOUT（40 U /μL） | Invitrogen公司 | 10777019 | |
| X - plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列* |
| DEPC处理水 |
反应体积：5.5μL
注：最终的茎环结构的引物浓度应1-5纳米（2纳米）。
准备主混合（每反应体积）如下：
| 1。 DEPC -水 | 1.959μL |
| 2。 10X RT -缓冲区 | 0.55μL |
| 3。核糖核酸酶抑制剂（40 U /μL） | 0.0715微升 |
| 4。的dNTP（100毫米） | 0.275μL |
| 5。 X - plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* | 0.275μL |
| 6。 MMLV RT（50 U /μL） | 0.369μL |
- 宓X和短暂离心。
- 2μL样品添加3.5μL主混合。
- 执行以下的RT反应：
16℃30分钟，由60个周期，在20 ° C 30秒，42 ° C为30秒，50 ° C为1秒，最后85 ° C时5分钟灭活MMLV - RT，4 ° C∞ 。 - 储存在-20 ° C，直到使用。
*反向的茎环结构的引物名单可以发现在http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5。预扩增（预PCR）
（由唐等协议。进行了修改。）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ | 评论 |
| 的dNTP（100毫米） | 美国应用生物系统公司 | 4368814 | 高第。 cDNA的归档包。 |
| 2个通用PCR扩增预混试剂NoAmpErase UNG | 美国应用生物系统公司 | 4324018 | |
| X - plex的正向引物组合（450纳米）* | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列* |
| 通用反向引物（100微米） | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列2 |
| AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） | 美国应用生物系统公司 | 4311806 | |
| MgCl 2的 （100毫米） | |||
| DEPC处理水 |
反应体积：27.5μl（22μlMM +5.5μlRT -产品）
注：前置放大是必要的，以提高信号强度，尤其是当起始RNA浓度是有限的。输入RNA水平决定前PCR循环的最佳数量。由于相同的相对效率，每个PCR循环最终产品的浓度增加一倍。由于一些miRNA将更加高效表达，避免过度骑自行车。然而，在放大，可能会导致检测灵敏度的损失，尤其是在低水平表达的microRNA。 12预扩增循环，使用100ng的总RNA，在我们的手中出现足够了。使用作为起始原料，经12个周期结果在检测的miRNA的水平，但15个周期似乎要优于血清。最后，3卵母细胞（约400 PG每个卵母细胞3的总RNA），16预扩增周期的开始，成功地使我们屏幕上的microRNA的表达水平4。
*正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
准备主混合（每反应体积）如下：
| 1。 2个通用MM | 13.75μL |
| 2。 DEPC -水 | 0.792μL |
| 3。 MgCl 2的 （100毫米） | 0.55μL |
| 4。的dNTP（100毫米） | 1.1μL |
| 5。 X - plex的正向引物组合（450纳米） | 3.06μL |
| 6。通用RP（100μmol） | 1.375μL |
| 7。 AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） | 1.375μL |
- 混合，短暂离心。
- 加入22μL法师组合，以每5.5μLRT - 产品。
- 执行以下预PCR反应：
95℃10分钟，55 ° C为2分钟，10 - 18 95 ° C的周期为1秒和65 ° C为1分，4 ° C∞。
6。前- PCR产物的纯化
10％的原生聚丙烯酰胺凝胶净化大小选择
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ |
| 40％丙烯酰胺/双解决方案 | Bio - Rad公司 | 161-0144 |
| TEMED | Bio - Rad公司 | 161-0801 |
| 10 bp的DNA阶梯 | Invitrogen公司 | 10821-015 |
| SYBR黄金核酸凝胶染色 10,000 ×集中在DMSO | Invitrogen公司 | S11494 |
| 糖原（20毫克/毫升） | 罗氏公司 | 10 901 393 001 |
| 缓冲器EB | ||
| 10％Ammoniumpersulfate（APS） | ||
| 10缓冲区 | ||
| 6X橙G | ||
| DEPC处理水 | ||
| ddH2O |
A.凝胶法制备
为了使10％的聚丙烯酰胺的混合物添加10毫升
| 1。 DDH 2 Ø | 6.5毫升 |
| 2。 10X TBE | 1毫升 |
| 3。聚丙烯酰胺（40％） | 2.5毫升 |
| 4。 APS（10％） | 80μL |
| 5。 TEMED | 4μL |
- 准备DNA梯状：
- 0.5μL10 bp的DNA阶梯
- 4.5μL缓冲液（EB）
- 1μL6X橙G
- 每27.5μL预- PCR产物5.5μL6X橙G。
B.运行凝胶
- 与150V运行55-60分钟的凝胶。
注：溴酚蓝为指示剂，用20bp区域运行。
C.染色凝胶
- 摇床25分钟的凝胶染色使用SYBR金。
注 ：SYBR的黄金对光敏感。
D.切割凝胶
- 切出60-80 BP前PCR产物带，并转移到标记管。
注：为低RNA输入预PCR产物带可能不可见。 - 粉碎凝胶带（如管离心管）。
E.重新提取的cDNA
- 加入300μl10缓冲区在37 ° C时4小时的肩。
- 一个标记收集管传输流体，添加另外300μL10缓冲区凝胶含管孵育4 ° C在肩过夜。
- 吸剩下的液体，转移到标记之前收集管，并注意总回收量。
F.乙醇沉淀
- 室温100％的乙醇添加3卷。
- 添加0.5μL糖原（20毫克/毫升）。
- 涡街流量计。
- 干冰放置至少2小时，或在-80 ° C过夜。
- 自旋在4 ° C离心30分钟以沉淀的cDNA在。
- 转储液，添加700μL室温75％乙醇和10分钟的旋转。
- 转储液和自旋为5分钟。
- 吸了10分钟，而不会干扰颗粒和空气干燥上清。
- 干净的水溶解沉淀。
注：集中cDNA的解决方案所需的量依赖于实验设计应包括对照实验。
7。前- PCR产物的纯化
其次是引物酶消化纯化离心柱（制造商协议）
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ |
| ExoSAP - IT | USB - Affymetrix公司 | 78250 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen公司 | 28004 |
注：独家酶清理成功切除引物在我们手中，但也导致了部分降解的预扩增产物，可能是由于部分短的产品随着温度升高80 ° C时的灭活步骤变性酶。避免热灭活和使用离心柱从酶反应的PCR产物直接净化删除任何无产品退化的底漆。
- 5μL后的PCR产物与2μLExoSAP - IT混合。
- 37 ° 15分钟，以降低其余的引物和核苷酸的彗星。
- 加入5的缓冲PB卷1体积的PCR反应和混合，如果pH值指示剂，我已添加到缓冲器PB，检查混合物的颜色是黄色。
- 在提供的2ml收集管放置在一个合适的机架的MinElute列。
- 应用范例MinElute列和1分钟的离心。
- 流丢弃，MinElute列到同一管内，并添加750μL缓冲体育MinElute列洗1分钟离心机。
- 丢弃流过，并在同一管内放置MinElute列回。离心机以最大的速度增加1分钟列。
- 放置在一个干净的1.5 ml离心管的MinElute列。
- 以洗脱DNA，加入10μLDEPC处理水的膜的中心，让站在列1分钟，然后CENtrifuge为1分钟。
8。 Fludigim 96.96 QRT - PCR分析
| 试剂名称 | 公司 | PROD /猫＃ | 评论 |
| Fluidigm公司96.96动态阵列套件 96.96动态阵列 96.96控制线液 20X载入试剂 | Fluidigm公司 | ||
| 混合的 通用反向引物（1μM） 正向引物（1μM） TaqMan探针（0.2微米） | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列（1） |
| 2个通用PCR扩增预混试剂 NoAmpErase UNG | 美国应用生物系统公司 | 4324018 | |
| 吐温 |
1。促发的96.96动态阵列国际金融公司
- 注入到每个芯片上的累加器的控制线液（150μL）。
- 将进入国际金融公司（集成流体通路）控制器芯片和运行总理（136x）脚本到芯片的控制线液总理。
注：芯片需要使用24小时后打开包装。请务必不要对泄漏物控制线液，因为控制芯片上，或在进气口线流体使芯片无法使用。芯片需要吸60分钟内加载。
2。准备样品
2.1前的样品制备
在一个一次性的塑料管，结合下面的表格，使样品预混合（每进气道卷）的组成部分。
| 2X的TaqMan通用的master mix | 2.5μL |
| 20X载入试剂 | 0.25μL |
注：最终成交量为2.75μL，为移液器盘盈免除损失
2.2样品制备
在96结合以及格式每个样品与样品预混合（每进气道卷）。
| 前样品混合 | 2.75μL |
| 样品 | 2.25μL |
注：涡和离心96孔板中，简要地收集液。
每个入口5μL的最后一卷，吹打考虑损失准备成交量略高。
2.3准备13X检测
- 使用96孔板准备13X检测。 1X浓度在下面的表格，规模达13倍。
| 通用反向引物 | 1微米（1个） | 2序列 |
| 正向引物* | 1微米（1个） | * |
| 基因特异性的TaqMan探针＃ | 0.2微米 | ＃ |
*正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
＃TaqMan探针的名单可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- 在浓度为0.25％，最终吐温吐温13X检测一个新的96孔板等分结合
注：每个入口的最终体积为5μL，准备足够的体积（5.5μL）期间损失量转移到。 - 拌匀，避免气泡，短暂离心收集液。
3。载入芯片
注：为了使样品和检测，确保芯片的正确定位正确加载。很方便的槽口对准左上角。
确保所有检测样品溶液混合，然后再加载芯片。这是方便做在96孔板和旋转，然后再加载芯片板。注意芯片的吹打，以供日后参考地图。
未使用的示例入口处应填2.75μL样品混合和2.25μLDNA自由水。
应填写未使用的检测进气口与2.5μL检测装载试剂和2.5μl水。
不要走过去的第一站，同时吹打，以避免引入气泡。
- 加载样品和检测（五后olume每个入口：5μL）运行负载混合脚本（136x）脚本来加载到芯片的样品和检测。
- 脚本已经完成后，删除从ICF控制器芯片。
- 剥离加载芯片底部的蓝色保护膜。
- 删除任何从芯片表面的灰尘颗粒或碎片。
4。 96.96定量RT - PCR检测
- BioMark系统传输芯片，并使用以下的扩增条件：
55℃2分钟，95 ° C为10分钟，40个周期为95 ° C为1分15秒和55℃。 - 按照制造商的数据采集软件的协议。
5。使用的qPCR分析软件
经过RT - PCR技术的专有软件提供的扩增曲线，每口井的热图和CT值。请参阅数据分析软件手册。
9。代表性的成果：
图1。图解实验的工作流程。所示是一个一步一步的多重定量RT - PCR协议的描述，包括从多重反转录（步骤C）和多路前置放大器的过度引物的净化（步骤E）（步骤d）前实时检测（步骤F），在纯化的QRT - PCR的cDNA模板。 FP：microRNA的具体正向引物，URP：通用反向引物，R - SLP：小分子RNA的特定反向茎环结构的引物。
点击这里为一个较大的图像。
图2。聚丙烯酰胺凝胶净化。QRT - PCR的模板后前 PCR - PCR产物的大小乐队专门在WT样本，但没有microRNA的缺陷DGCR8 - / -或Dicer酶- / -样本（箭头）后96复杂RT和12周期的前置放大。请注意，非特定产品来源不明（箭头）和过量引物在所有样本中发现（星级）。
图3。净化多重前置放大后，大大提高了定量RT - PCR结果的精度比较的相对表达水平的WT MESC）DGCR8 - / - （缺乏规范的microRNA）MESC揭示1）更多的小分子RNA的检测和2）假阳性的损失/ - -在DGCR8信号的背景后，净化了引物- PCR产物。二）经纯化后，双方DGCR8的相对表达水平- / - / WT 和 Dicer - / - / WT显示假阳性信号的损失，并允许适当的分类罕见DGCR8 独立/ Dicer的依赖性小分子RNA（miR - 320的， - 484，-877）5。
图4。 Fluidigm公司的高通量定量RT - PCR检测miRNA表达谱。屏幕截图96.96 Fluidigm公司QRT - PCR mircoRNA分析屏幕为前列腺癌患者血清miRNA的水平的改变。实时定量PCR分析软件提供的扩增曲线，色码热图和循环阈值（CT）。
Discussion
miRNA是短（18-24个核苷酸），非编码RNA，从而调节基因表达的转录后由两个不稳定的信使RNA（mRNA）的抑制其翻译。6，至少有三分之一的人类基因组包含保守的miRNA约束力的网站在他们的3'UTR和多能性，增殖和凋亡基因的miRNA明显的相互作用，表明在细胞命运的决定，组织动态平衡和癌症等疾病的重要贡献6,7因此，准确的microRNA表达谱广泛。兴趣。
为了测试发布的多重定量RT - PCR检测miRNA 表达谱协议2，我们作为阴性对照的小分子RNA的缺陷MESC。 DGCR8 - / -细胞缺乏规范的microRNA，而Dicer的- / -细胞缺乏规范和非canoncial micoRNAs 8,9
比较野生型水平的MES DGCR8 - / -细胞，我们发现几个表示没有检测到野生型细胞11 10小分子RNA的缺乏准确性。有的甚至呈相对较低的表达水平的基因敲除细胞（图3a）。我们推测，可能会造成大量的引物进行两个连续的多重步骤之前RT定量单一（RT和前PCR）缺乏准确性。然而，多重预扩增是必要的，以提高信号强度，尤其是当起始RNA浓度是有限的。净化远离本地聚丙烯酰胺凝胶电泳（图2）的大小选择的引物- PCR产物，我们可以证明，通过检测microRNA和假阳性信号的损失都DGCR8在精度显着改善 - / -和 Dicer - / -另外的背景（图3a和3b）修改后的QRT - PCR的方法，允许适当的分类DGCR8罕见的独立 / Dicer的依赖小分子RNA（ 图 3b ）11。因此，一个额外的步骤，以净化过量引物离预PCR产物是明显的优势，尤其是当使用大型复用底漆，每样本集。
预扩增周期的最佳人数是由输入RNA浓度。不能下或平衡overamplify应遵循的具体实验的详情。
与千余名已知的microRNA，使用标准的384孔板未必最广泛的microRNA分析，尤其是在比较多个样本。 Fluidigm公司的动态阵列国际金融公司使，用移液步骤和所需化学显着下降，以96对96纳升规模（6.7 NL）（9216反应）在一次实验中在不同的小分子RNA的个别样品测试。对于每一个运行的分析软件提供的扩增曲线，色码热图和循环阈值（CT）。同时大规模的分析，降低实验的差异，并允许平均表达式的值正常化，这出执行其他正常化战略，利用小分子RNA控制的。
相比市售384预先指定的TaqMan探针的良好平台，与定制引物的高通量分析平台的结合提供了实验的灵活性高。
优化的多重定量RT - PCR技术相结合的方式，用动态数组平台成功地允许我们同时屏幕改建48个前列腺癌患者血清中384的miRNA（图4）的水平，并没有控制穗（即合成的microRNA）的数据正常化。 11
尽管增加从样品制备到分析结果步骤，描述的方法是一个时间和成本效益的高通量方法简介miRNA表达水平的大样本集，即使在有限的起始原料。
Disclosures
艾伦米尔是Fluidigm公司的雇员。否则，我们没有披露的财务利益。
Acknowledgments
我们想感谢Blelloch实验室评论文本。这项工作是由来自美国国立卫生研究院（K08 NS48118和R01 NS057221），加州再生医学研究所（CIRM）（种子补助RS1 - 00161，新教师奖RN2 - 00906）和皮尤慈善信托基金到RB和调频支持Wissenschaftlich Urologische GESELLSCHAFT EV。
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
