Summary
Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.
Abstract
Un ampio coinvolgimento dei miRNA nei processi critici di fondo dello sviluppo, dell'omeostasi dei tessuti e la malattia ha portato ad un interesse in aumento fra le comunità di ricerca e farmaceutica. Per studiare miRNA, è essenziale che la quantificazione dei livelli di microRNA è preciso e robusto. Confrontando wild-type di piccoli RNA deficienti cellule staminali embrionali di topo (Mesc), ci ha rivelato una mancanza di precisione e robustezza nelle precedenti pubblicati qRT multiplex-PCR tecniche. Qui, descriviamo un metodo ottimizzato, anche purificare lontano primer eccessivo passi multiplex precedente prima rilevazione singleplex tempo reale, che aumenta notevolmente la precisione e la solidità della tecnica. Inoltre, abbiamo spiegato come eseguire la tecnica su un chip microfluidica a volumi nanoliter riduce significativamente i costi dei reagenti e il tempo lo permette efficace ad alta velocità miRNA profili di espressione.
Protocol
1. RNA-Estrazione: cellule coltivate in monostrato
(Dopo il protocollo del costruttore, utilizzando TRIzol.)
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # |
| TRIzol Soluzione | Invitrogen | 15596-018 |
| Alcol isopropilico | Sigma-Aldrich | 1907-64 |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Etanolo | ||
| RNasi libero dell'acqua |
Omogeneizzazione
- Omogeneizzare le cellule direttamente sul piatto della cultura con l'aggiunta di 1 Soluzione Trizol ml per 10 cm 2 Superficie piatto, agitare il Trizol intorno e pipetta su e giù per garantire una copertura completa della piastra.
Fase di separazione
- Incubare il campione omogeneizzato per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire in una provetta, aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml e agitare TrizolSolution tubo vigorosamente a mano per 15 secondi.
- Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
- Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti a 2 ° C. Dopo la centrifugazione la miscela si separa in una fase di bassa rossa, un interfase e una fase superiore acquosa incolore, che contiene l'RNA e dovrebbe essere il 60% del volume totale Soluzione Trizol.
RNA Precipitazioni
- Trasferire la soluzione acquosa, contenente l'RNA in una fase fresca, provetta.
- Precipitare l'RNA aggiungendo 0,5 ml di alcool isopropilico per 1 ml di soluzione Trizol.
- Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Centrifugare a 12000 xg per 10 minuti a 2 ° C.
RNA-wash
- Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dai tubi.
- Lavare il pellet di RNA (sul lato e fondo della provetta) con l'aggiunta di almeno 1 ml di etanolo 75% per 1 ml di soluzione Trizol, vortice.
- Centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 2 ° C.
RNA eluizione
- Scartare il surnatante e centrifugare ancora per 1 minuto. Rimuovere il liquido eccessivo.
- Far asciugare pellet per 5-10 minuti.
Nota: oltre secca RNA è difficile da solubilizzare. - Riprendere il pellet in acqua RNase libero pipettando la soluzione su e giù e incubare per 10 minuti a 55 ° C.
- Misurare la concentrazione di RNA (A260/280 ratio) utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ™.
- Conservare a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo.
2. RNA-Estrazione: Siero
(Protocollo seguito Mirvana PARIGI produttore Kit modificato da Mitchell et al. 1)
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # | Commenti |
| mir Vana PARIGI Kit 2X Soluzione di denaturazione Acido-fenolo: cloroformio miRNA soluzione di lavaggio 1 miRNA soluzione di lavaggio 2 / 3 | Ambion | AM1556 | Modificato il protocollo |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Etanolo | |||
| DEPC trattamento acqua |
Chimica Preparazione:
- Aggiungere 375 ml di 2-mercaptoetanolo alla Soluzione 2X denaturazione e mescolare bene.
- Aggiungere 21 ml di etanolo 100% per la soluzione di lavaggio miRNA 1.
- Aggiungere 40 ml di etanolo 100% per la soluzione di lavaggio miRNA 2 / 3.
Preparazione del campione:
- Disgelo campione di siero su ghiaccio.
Omogeneizzazione
- Mescolare 300 microlitri del campione con un uguale volume (300 mL) di 2X Soluzione di denaturazione (dovrebbe essere a temperatura ambiente) e vortice.
- Incubare miscela in ghiaccio per 5 minuti.
- Aggiungere un volume di acido-fenolo: cloroformio pari al volume totale del campione lisato più la soluzione di 2X denaturazione (600 microlitri).
Importante: non utilizzare il tampone acquoso che si trova sulla parte superiore del acido-fenolo: cloroformio. - Miscela vortex per 60 secondi.
- Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti alla massima velocità (> 10.000 xg). Dopo la centrifugazione la miscela si separa in una fase superiore acquosa, una interfase e una fase organica inferiore.
- Rimuovere Aquestrato di unità organizzative in alto (dovrebbe essere 300-500 microlitri comprese eventuali proteinacious livello "nebuloso").
- Riestrarre strato acquoso come prima di nuovo aggiungendo cloroformio.
Importante: Lo strato acquoso della seconda estrazione è normalmente più piccolo in volume (250 microlitri). Annotare il volume recuperato.
Preparazione di Final RNA Isolation (RNA totale)
- Pre-riscaldamento (95 ° C) acqua priva di nucleasi.
- 100% di etanolo deve essere a temperatura ambiente.
Finale RNA Isolation (RNA totale)
- Aggiungi 1,25 volumi di etanolo 100% alla fase acquosa recuperata (ad esempio se è stato recuperato 300 ul, aggiungere 375 microlitri di etanolo) e mescolare accuratamente.
- Per ogni campione, inserire una cartuccia filtrante in uno dei tubi di raccolta.
- Pipettare il lisato sul filtro.
- Centrifugare (10.000 xg) per 30 secondi, scartare il flusso continuo, centrifuga di nuovo per 30 secondi e sostituire la cartuccia del filtro nel tubo di raccolta stesso.
RNA-Wash
- Applicare 700 microlitri soluzione di lavaggio da 1 a miRNA la cartuccia del filtro e centrifugare per 15 secondi, scartare il flow-through dal tubo di raccolta, e sostituire la cartuccia del filtro nel tubo di raccolta stesso.
- Applicare 500 microlitri soluzione di lavaggio miRNA 2 / 3, centrifugare per 15 secondi, scartare il flow-through e ripetere con un secondo 500 microlitri di soluzione di lavaggio 2 / 3.
- Gettare il flow-through e secco girare per 1-2 minuti.
- Cartuccia filtrante posto in un tubo collezione fresca, applicare 100 ul RNasi acqua libera (95 ° C), cap chiudere e incubare per 2 minuti.
- Centrifugare per circa 2 minuti per recuperare l'RNA.
- Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Concentrazione di RNA-Solution (5X)
(A seguito di protocollo per la fabbricazione di)
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # |
| Microcontrollore Dispositivi centrifuga Filtro Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC trattamento acqua |
Dispositivo: microcontrollore Ultracell YM-3, Cutoff SS e Nucleotidi DS: 10
Volume: il volume desiderato di ri-soluzione concentrata di RNA dipende disegno sperimentale e dovrebbe includere esperimenti di controllo.
- Inserire campione serbatoio microcontrollore nella fiala e la soluzione di pipetta nel serbatoio.
Nota: Non toccare la membrana. - Centrifugare per 185 minuti a 4 ° C con massima 14.000 x g.
Nota: flaconcino di posizione con banda crepa verso il rotore. - Pipettare il volume d'acqua desiderata RNasi gratuito (ad es 20 l) sul serbatoio, serbatoio posto invertita in un nuovo flacone e girare per 3 minuti a 4 ° C con massima 3000 x g.
- Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
4. Trascrizione inversa
(A seguito di un protocollo di Tang et al. 2 con modifiche).
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # | Commenti |
| Alta capacità di archivio kit cDNA 10x Buffer cDNA archiviazione dNTP (100 mm) Moloney virus della leucemia murina (MMLV) trascrittasi inversa (50 U / mL) | Applied Biosystems | 4368814 | modificato il protocollo |
| RNaseOUT (40 U / mL) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-plex reverse stem-loop mix di fondo (40 nM) * | Integrated DNA Technologies | Costume | Sequenze * |
| DEPC trattamento acqua |
Volume di reazione: 5,5 microlitri
Nota: la concentrazione finale della radice-loop primers dovrebbero essere 1-5 nM (qui 2 nM).
Preparare Master-Mix (Volumi per reazione) come segue:
| 1. DEPC-Water | 1,959 microlitri |
| 2. 10x RT-Buffer | 0,55 microlitri |
| 3. RNasi inibitore (40 U / mL) | 0,0715 microlitri |
| 4. dNTP (100 mm) | 0,275 microlitri |
| 5. x-plex reverse stem-loop mix di fondo (40 nM) * | 0,275 microlitri |
| 6. MMLV-RT (50 U / mL) | 0,369 microlitri |
- Mix e una breve centrifuga.
- Aggiungere 3,5 microlitri Master-Mix a 2 microlitri del campione.
- Eseguire le seguenti RT-reazione:
16 ° C per 30 minuti, seguita da 60 cicli a 20 ° C per 30 secondi, 42 ° C per 30 secondi, 50 ° C per 1 secondo e infine 85 ° C per 5 minuti per inattivare MMLV-RT, 4 ° C ∞ . - Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
* Elenco di invertire stem-loop primer sono disponibili all'indirizzo http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Pre-amplificazione (Pre-PCR)
(A seguito di un protocollo di Tang et al. 2 con modifiche).
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # | Commenti |
| dNTP (100 mm) | Applied Biosystems | 4368814 | Tappo alto. archivio Kit cDNA. |
| 2x universale PCR Master Mix con NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-plex avanti mix di fondo (450 Nm) * | Integrated DNA Technologies | Costume | Sequenze * |
| Primer universale Reverse (100 mM) | Integrated DNA Technologies | Costume | Sequenza 2 |
| AmpliTaqGold polimerasi (5 U / mL) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC trattamento acqua |
Volume di reazione: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-prodotto)
Nota: Pre-amplificazione è necessario rafforzare la potenza del segnale, soprattutto quando la concentrazione di partenza di RNA è limitata. Il livello di ingresso di RNA determina il numero ottimale di pre-PCR cicli. Data la stessa efficienza relativa ad ogni ciclo di PCR dovrebbe raddoppiare la concentrazione del prodotto finale. Dal momento che alcuni microRNA sarà più altamente espresso, evitare un eccesso di ciclismo. Tuttavia, in-amplificazione può provocare una perdita di sensibilità di rilevazione, soprattutto per i microRNA espresso a bassi livelli. Nelle nostre mani 12 cicli di amplificazione pre, utilizzando 100 ng di RNA totale, sembrava sufficiente. Utilizzando siero come materiale di partenza, 12 risultati cicli nei livelli di miRNA individuabili, ma in 15 cicli sembrava essere superiore. Infine, a partire con 3 ovociti (circa 400 pg di RNA totale per ovocita 3), 16 cicli di pre-amplificazione con successo ci ha permesso di schermo per i livelli di espressione di microRNA 4.
* Elenco di primer in avanti si possono trovare a http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Preparare Master-Mix (Volumi per reazione) come segue:
| 1. 2x universale MM | 13,75 microlitri |
| 2. DEPC-Water | 0,792 microlitri |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0,55 microlitri |
| 4. dNTP (100 mm) | 1,1 microlitri |
| 5. x-plex avanti mix di fondo (450 nm) | 3,06 microlitri |
| 6. Universale RP (100 mM) | Microlitri 1,375 |
| 7. AmpliTaqGold polimerasi (5 U / mL) | Microlitri 1,375 |
- Mescolare e centrifugare brevemente.
- Aggiungere 22 microlitri Master-Mix per ogni 5,5 microlitri RT-prodotto.
- Effettuare le seguenti operazioni di pre-PCR, reazione:
95 ° C per 10 min, 55 ° C per 2 minuti, seguite da 10-18 cicli di 95 ° C per 1 s e 65 ° C per 1 min, 4 ° C ∞.
6. Purificazione del Pre-PCR prodotto
Purificazione di selezione del formato su un gel al 10% poliacrilammide nativo
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # |
| 40% di acrilamide / Soluzione Bis | Bio-Rad | 161-0144 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 bp DNA ladder | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR gel di acido nucleico macchia d'Oro 10.000 concentrarsi X in DMSO | Invitrogen | S11494 |
| Glicogeno (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Buffer-EB | ||
| 10% Ammoniumpersulfate (APS) | ||
| TEN-Buffer | ||
| 6x Arancio G | ||
| DEPC trattamento acqua | ||
| ddH2O |
a. Preparazione gel
Per fare 10 ml di una miscela poliacrilammide addizionale del 10%
| 1. DDH 2 O | 6,5 ml |
| 2. TBE 10x | 1 ml |
| 3. Poliacrilammide (40%) | 2,5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 microlitri |
| 5. TEMED | 4 microlitri |
- Preparare scaletta del DNA:
- 0,5 microlitri 10 bp DNA ladder
- Buffer 4,5 microlitri (EB)
- 1 ml 6x Arancio G
- Aggiungere 5,5 microlitri 6x G Orange per ogni microlitri 27,5 Pre-PCR prodotto.
b. Esegui Gel
- Esegui Gel con 150V per 55-60 minuti.
Nota: blu di bromofenolo come indicatore corre con la regione 20bp.
c. Macchia Gel
- Macchia gel con SYBR-Gold per 25 minuti su agitatore.
Nota: SYBR-Gold è sensibile alla luce.
d. Cut Gel
- Tagliare Pre-PCR banda prodotto 60-80 bp e trasferimento in provetta.
Nota: Una banda di bassa ingresso RNA pre-PCR prodotti potrebbero non essere visibili. - Crush banda gel (ad esempio in tubo di centrifugazione tubo).
e. Re-Estratto di cDNA
- Aggiungere 300 ml di TEN-Buffer e incubare a 37 ° C per 4 ore su un rotatore.
- Il trasferimento di fluidi ad un tubo di raccolta etichetta, aggiungere un altro 300 ul TEN-Buffer al gel contenenti tubi e incubare il tutto a 4 ° C per una notte su un rotatore.
- Aspirare il liquido residuo, trasferire al tubo di raccolta etichettati come prima e prendere nota del volume totale recuperato.
f. Etanolo Precipitazioni
- Aggiungere 3 volumi di etanolo a temperatura ambiente al 100%.
- Aggiungere 0,5 microlitri glicogeno (20 mg / ml).
- Vortex.
- Incubare in ghiaccio secco per almeno 2 ore oppure a -80 ° C durante la notte.
- Spin in microcentrifuga a 4 ° C per 30 minuti per far sedimentare cDNA.
- Dump fluido, aggiungere 700 microlitri temperatura ambiente 75% di etanolo e di spin per 10 minuti.
- Dump fluido e spin ancora per 5 minuti.
- Succhiano surnatante senza disturbare pellet e aria secca per 10 minuti.
- Riprendere il pellet in acqua pulita.
Nota: il volume desiderato di soluzione concentrata di cDNA dipende dal disegno sperimentale e dovrebbe includere esperimenti di controllo.
7. Purificazione del Pre-PCR prodotto
Purificazione per digestione enzimatica di primer seguito da Spin Column (seguendo le produce protocolli)
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 |
Nota: Nelle nostre mani l'esclusiva enzimatica di pulizia primer rimosso con successo, ma anche portato alla parziale degradazione del prodotto pre-amplificata, forse a causa di parziale denaturazione dei prodotti breve temperatura sale fino a 80 ° C durante la fase di inattivazione del enzima. Evitare l'inattivazione di calore e direttamente purificare i prodotti di PCR dalla reazione enzimatica utilizzando colonne di rotazione rimuove qualsiasi fondo senza degradazione del prodotto.
- Mescolare 5 microlitri post-PCR prodotto con 2 microlitri ExoSAP-IT.
- Incubare a 37 ° C per 15 minuti a degradare primer residuo e nucleotidi.
- Aggiungere 5 volumi di tampone PB per 1 volume di reazione di PCR e mescolare, se mi indicatore di pH è stato aggiunto a tampone PB, verificare che il colore della miscela è di colore giallo.
- Inserire una colonna MinElute in una fornita 2 ml di tubo di raccolta in un rack adatto.
- Applicare il campione alla colonna MinElute e centrifugare per 1 minuto.
- Gettare flusso continuo, posto la colonna MinElute indietro nel tubo stesso e aggiungere 750 microlitri Buffer PE alla colonna MinElute da lavare e centrifugare per 1 minuto.
- Gettare flow-through e posto sul retro MinElute colonna nel tubo stesso. Centrifugare la colonna per un ulteriore 1 minuto a velocità massima.
- Posizionare la colonna MinElute in un ambiente pulito tubo 1,5 ml microcentrifuga.
- Per eluire il DNA, aggiungere 10 microlitri di acqua DEPC trattata al centro della membrana, lascia la colonna riposare per 1 minuto, e poi centritrifuge per 1 minuto.
8. Fludigim 96,96 qRT-PCR Profiling
| Nome del reagente | Azienda | Prod / Cat # | Commenti |
| Fluidigm 96,96 Kit di matrice dinamica 96,96 array dinamico 96,96 controllo dei fluidi linea 20x Caricamento dei reagenti | Fluidigm Corporation | ||
| Mix di Primer universale inversa (1 mM) Primer in avanti (1 mM) TaqMan sonda (0,2 mM) | Integrated DNA Technologies | Costume | Sequence (1) |
| 2x universale PCR Master Mix con NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Priming il 96,96 IFC matrice dinamica
- Iniettare linea fluida di controllo (150 microlitri) in ciascuna delle accumulatori sul chip.
- Chip posto nella (circuito fluidico integrato) del controller IFC ed eseguire il (136x) Primo script per fluido primario linea di controllo nel chip.
Nota: Chip deve essere utilizzato 24 ore dopo l'apertura della confezione. Assicurarsi di non versare il liquido linea di controllo in quanto linea fluida controllo sul chip o nelle insenature rende il chip inutilizzabile. Chip ha bisogno di essere caricati entro 60 minuti di adescamento.
2. La preparazione dei campioni
2,1 Pre-Preparazione del campione
In un tubo di plastica usa e getta, combinare i componenti nella tabella seguente per rendere il campione-Pre-Mix (per volumi di ingresso).
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2,5 microlitri |
| 20x Caricamento dei reagenti | 0,25 microlitri |
Nota: il volume finale è di 2,75 microlitri, come fuori quota per pipetta dispensare le perdite
2,2 di preparazione del campione
Combina in 96 e formattare ogni campione con pre-campione mix (volumi per ingresso).
| Pre-Sample-Mix | 2,75 microlitri |
| Campione | 2,25 microlitri |
Nota: Vortex e centrifugare 96 pozzetti brevemente per raccogliere il fluido.
Volume finale per ingresso 5 microlitri, prendere pipettaggio perdita in considerazione la preparazione del volume leggermente superiore.
2.3 Preparazione dei saggi 13x
- Utilizzare una piastra da 96 pozzetti per preparare saggi 13x. 1x concentrazioni nella tabella qui sotto, la scala per 13x.
| Primer universale Reverse | 1 micron (1x) | Sequenza in 2 |
| Primer * avanti | 1 micron (1x) | * |
| Gene specifico della sonda TaqMan # | 0,2 micron | # |
* Elenco di primer in avanti si possono trovare a http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Lista n ° di sonde TaqMan sono disponibili all'indirizzo http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- Combinano in una nuova piastra ben 96 aliquote dei saggi 13x con Tween per una concentrazione di 0,25% Tween finale
Nota: il volume finale per ogni ingresso è di 5 microlitri, preparare un volume sufficiente (5,5 microlitri) di prendere la perdita durante il trasferimento di volume in considerazione. - Mescolare bene, evitando le bolle e centrifugare brevemente per raccogliere il fluido.
3. Caricamento in corso il chip
Nota: Al fine di consentire il corretto caricamento dei campioni e saggi di garantire il corretto posizionamento del chip. E 'conveniente per allineare la tacca verso l'angolo in alto a sinistra.
Assicurarsi che tutte le analisi e le soluzioni campione sono mescolati prima di caricare il chip. È conveniente fare questo in una piastra da 96 pozzetti e girare il piatto prima di caricare il chip. Essere a conoscenza della mappa chip di pipettaggio per riferimento futuro.
Insenature del campione non utilizzata deve essere riempito con 2,75 Mix campione microlitri di acqua e 2,25 microlitri di DNA libero.
Insenature saggio non utilizzati devono essere riempiti con 2,5 microlitri di reagente del test di carico e 2,5 microlitri di acqua.
Non andare oltre il primo arresto durante il pipettaggio per evitare di introdurre bolle d'aria.
- Dopo aver caricato i campioni e le analisi (Volume per ingresso: 5 microlitri) eseguire lo script di Mix di carico (136x) script per caricare i campioni e analisi nel chip.
- Dopo che lo script è terminato, rimuovere il chip dal controller ICF.
- Sbucciare la pellicola protettiva azzurra dal lato inferiore del chip caricato.
- Rimuovere eventuali particelle di polvere o detriti dalla superficie del chip.
4. 96,96 qRT-PCR
- Trasferire il chip al sistema BioMark e utilizzare le seguenti condizioni di amplificazione:
55 ° C per 2 minuti, 95 ° C per 10 minuti, seguita da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 55 ° C per 1 min. - Seguire il protocollo produzione per la raccolta dei dati del software.
5. Utilizzando il software di analisi qPCR
Dopo RT-PCR il software proprietario fornisce le curve di amplificazione, mappe di calore e valori Ct per ogni bene. Si prega di fare riferimento al manuale del software per l'analisi dei dati.
9. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Mostrato è un passo-passo la descrizione del protocollo qRT multiplex-PCR, tra cui la purificazione (E Step) di primer eccessivo multiplex trascrizione inversa (Fase C) e preamplificazione multiplex (Fase D) prima di rilevamento in tempo reale (Fase F), risultando in un modello di cDNA purificato per qRT-PCR. FP: microRNA primer specifico in avanti, URP: primer reverse universale, R-SLP: microRNA specifici reverse stem-loop primer.
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Figura 2. . Purificazione gel Polyacryamide del qRT-PCR modello dopo pre-PCR Bande di pre-PCR dimensioni del prodotto sono esclusivamente visti in campioni di WT, ma non in microRNA carente DGCR8 - / - o Dicer - / - campioni (frecce) dopo 96-plex RT e 12 cicli di preamplificazione. Si noti che non specifici prodotti di origine sconosciuta (punte di freccia) e primer eccessivo si trovano in tutti i campioni (stelle).
Figura 3. Purificazione dopo preamplificazione multiplex migliora notevolmente la precisione di qRT-PCR risultati a) Confronto dei livelli di espressione relativa di WT Mesc a Dgcr8 -. / - (MicroRNA canonica carente) Mesc rivela 1) la rilevazione di più microRNA e 2) la perdita di falso positivo segnali in Dgcr8 - / - sfondi dopo purificazione via primer di pre-PCR prodotto. b) dopo la depurazione, i livelli di espressione relativa di entrambi DGCR8 - / - / WT e Dicer - / - / WT mostrano una perdita di falsi segnali positivi e consentono di categorizzazione corretta di rara Dgcr8 RNA dipendente indipendente / Dicer piccolo (miR-320, - 484, -877) 5.
Figura 4. Fluidigm high-throughput qRT-PCR profiling miRNA. Esempio schermata di 96,96 Fluidigm qRT-PCR profiling mircoRNA a schermo per l'alterazione dei livelli di miRNA sieri malato di cancro alla prostata. In tempo reale software di analisi qPCR fornisce le curve di amplificazione, colori mappe di calore e la soglia ciclo (Ct).
Discussion
miRNA sono brevi (18-24 nucleotidi) non codificanti miRNA RNA, che regolano l'espressione genica post-trascrizionale di RNA messaggero sia destabilizzante (mRNA) e inibendo la loro traduzione. 6 Il fatto che almeno un terzo dei geni umani contengono conservato vincolanti nei loro siti-3'UTR e le interazioni evidenti dei miRNA con i geni per la pluripotenza, la proliferazione e l'apoptosi suggerisce un contributo critico nelle decisioni il destino della cellula, omeostasi dei tessuti e malattie come il cancro. 6,7 Quindi precisa profili di espressione di microRNA sono di ampio interesse.
Per testare la multisala pubblicato qRT-PCR l'espressione protocollo miRNA profiling 2 abbiamo usato piccoli Mesc carente RNA come controlli negativi. DGCR8 - / - cellule sono carenti di tutti i microRNA canonica, mentre Dicer - / -. Cellule mancanza micoRNAs sia canoniche e non canoncial 8,9
Confrontando i livelli di tipo selvatico MES-to DGCR8 - / - cellule, abbiamo scoperto la mancanza di precisione, come espresso più 10 microRNA non sono stati rilevati nel wild-type cellule 11. Alcuni addirittura hanno mostrato livelli di espressione più bassi rispetto alle cellule ad eliminazione diretta (Figura 3). Abbiamo ipotizzato che la mancanza di precisione potrebbe essere causato dal fondo massiccia riporto di due multiplex fasi consecutive (RT e Pre-PCR) prima singleplex RT-quantificazione. Tuttavia, multiplex di pre-amplificazione è necessaria per migliorare la potenza del segnale, soprattutto quando la concentrazione di partenza di RNA è limitata. Purificando via pre-PCR prodotti da primer di selezione del formato in gel di poliacrilammide nativo (Figura 2), abbiamo potuto dimostrare un sostanziale miglioramento della precisione rilevando più microRNA e una perdita di falsi segnali positivi in entrambi i Dgcr8 - / - e Dicer - / - sfondi (Figure 3a e 3b) Oltre la modifica qRT-PCR approccio ha permesso per la categorizzazione corretta di rara Dgcr8 RNA dipendente indipendente / Dicer di piccole dimensioni (Figura 3b) 11. Quindi un ulteriore passo per purificare primer eccessiva distanza dalla pre-PCR prodotto è chiaramente vantaggioso, soprattutto quando si utilizzano grandi multiplex fondo set per campione.
Il numero ottimale di pre-amplificazione dei cicli è determinata dalla concentrazione di RNA di ingresso. Il saldo di non sottovalutare o overamplify dovrebbe essere guidato da indicazioni specifiche dell'esperimento.
Con oltre un migliaio di microRNA noto, l'uso di standard di 384 pozzetti potrebbe non essere ottimale per il profiling microRNA ampia, soprattutto quando si confrontano campioni multipli. L'IFC Fluidigm Array dinamico consente, con una diminuzione significativa di passi pipettaggio e della chimica necessari, i test fino a 96 campioni individuali contro 96 differenti microRNA in un singolo esperimento (9216 reazioni) a scala nanolitri (6,7 nL). Per ogni esecuzione il software di analisi fornisce le curve di amplificazione, colori mappe di calore e dei valori del ciclo soglia (Ct). Il simultaneo su larga scala profilazione riduce le variazioni sperimentali e consente la normalizzazione valore medio di espressione, che fuori effettua strategie di normalizzazione altri che fanno uso di piccoli controlli RNA 12.
Rispetto al commercio 384 piattaforme bene con pre-assegnato sonde TaqMan, la combinazione di un elevato throughput piattaforma profilatura con misura set di primer offre un'elevata flessibilità di sperimentazione.
La ottimizzato multiplex qRT-PCR approccio in combinazione con la piattaforma di array dinamici con successo ci ha permesso di schermo contemporaneamente 48 cancro alla prostata sieri dei pazienti per le alterazioni dei livelli di 384 miRNA (Figura 4) e per normalizzare i dati senza picchi nei controlli (cioè sintetici microRNA). 11
Nonostante l'aumento dei passaggi dalla preparazione dei campioni ai risultati profilazione, l'approccio descritto è un tempo-e conveniente metodo throughput elevato per set di profilo ampio campione per i livelli di espressione di miRNA, anche con limitata materiale di partenza.
Disclosures
Alan Mir è un dipendente di Fluidigm Corporation. Altrimenti, non abbiamo interessi finanziari di rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il laboratorio Blelloch per commentare il testo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di RB dal NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (semi di Grant RS1-00161, Premio Facoltà di New RN2-00906) e Pew Charitable Trust e FM dal Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
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