Summary
यहाँ हम एक समय और लागत प्रभावी उच्च throughput (miRNA) microRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में एक microfluidic मंच के साथ एक अनुकूलित मल्टीप्लेक्स रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मात्रात्मक पीसीआर (QRT पीसीआर) संयोजन में प्रोटोकॉल का वर्णन है, खासकर जब नमूना की सीमित मात्रा में के साथ काम कर रहा है.
Abstract
महत्वपूर्ण विकास, ऊतक homoeostasis और रोग के अंतर्निहित प्रक्रियाओं में miRNAs की व्यापक भागीदारी अनुसंधान और दवा समुदायों के बीच बढ़ती ब्याज के लिए नेतृत्व किया गया है. MiRNAs अध्ययन करने के लिए, यह आवश्यक है कि microRNA स्तर की मात्रा का ठहराव सटीक और मजबूत है. छोटे आरएनए की कमी माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESC) को जंगली प्रकार की तुलना करके, हम सटीकता और पिछले प्रकाशित मल्टीप्लेक्स QRT-पीसीआर तकनीकों में मजबूती की कमी का पता चला. यहाँ, हम दूर singleplex वास्तविक समय का पता लगाने, जो नाटकीय रूप से सटीकता और तकनीक की मजबूती बढ़ जाती है पहले पिछले मल्टीप्लेक्स कदम से अत्यधिक प्राइमरों सफ़ाई सहित एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है. इसके अलावा, हम समझाने की कैसे nanoliter मात्रा में एक चिप पर microfluidic तकनीक का प्रदर्शन काफी अभिकर्मक लागत कम कर देता है और समय प्रभावी उच्च throughput miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा परमिट है.
Protocol
1. आरएनए एक्सट्रैक्शन: कक्ष monolayer में बढ़ी
(निर्माता TRIzol का उपयोग प्रोटोकॉल के बाद.)
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # |
| TRIzol समाधान | Invitrogen | 15596-018 |
| Isopropyl शराब | सिग्मा Aldrich | 1907-64 |
| क्लोरोफार्म | सिग्मा Aldrich | 2432 सी |
| इथेनॉल | ||
| RNase मुफ्त पानी |
Homogenization
- प्रति 10 सेमी 2 पकवान क्षेत्र 1 मिलीलीटर Trizol समाधान जोड़ने के आसपास Trizol ज़ुल्फ़ द्वारा संस्कृति डिश पर सीधे कोशिकाओं homogenize और विंदुक ऊपर और नीचे थाली का पूरा कवरेज सुनिश्चित है.
चरण पृथक्करण
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए homogenized नमूना सेते हैं.
- एक लेबल ट्यूब में स्थानांतरण, क्लोरोफॉर्म प्रति 1ml TrizolSolution 0.2 मिलीलीटर जोड़ने और ट्यूब सख्ती से 15 सेकंड के लिए हाथ से हिला.
- 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 12,000 XG पर 15 मिनट के लिए 2 नमूना अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस Centrifugation के बाद मिश्रण एक कम लाल चरण, एक interphase और एक बेरंग ऊपरी जलीय चरण है, जो शाही सेना शामिल में अलग और कुल Trizol समाधान मात्रा का 60% होना चाहिए.
शाही सेना वर्षा
- जलीय स्थानांतरण, शाही सेना एक ताजा, लेबल ट्यूब में चरण युक्त.
- Trizol समाधान के 1 मिलीलीटर प्रति isopropyl शराब के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर शाही सेना वेग.
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं.
- 2 में 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
आरएनए धोने
- Centrifugation के बाद, ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- Trizol समाधान, भंवर के 1 मिलीग्राम प्रति 75% इथेनॉल के कम से कम 1 मिलीलीटर जोड़कर शाही सेना गोली (ट्यूब के पक्ष और तल पर) धो लें.
- 2 में 5 मिनट के लिए 7500 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
शाही सेना Elution
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र. अत्यधिक तरल निकालें.
- एयर 5-10 मिनट के लिए सूखी गोली.
नोट: सूखे शाही सेना पर solubilize मुश्किल है. - RNase मुफ्त पानी में गोली समाधान ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Redissolve और 55 में 10 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- शाही सेना (A260/280 अनुपात) एकाग्रता एक Nanodrop ™ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग उपाय.
- जब तक सी -80 ° उपयोग करने के लिए तैयार स्टोर.
2. आरएनए एक्सट्रैक्शन: सीरम
(के बाद mirVana पैरिस किट निर्माता प्रोटोकॉल मिशेल एट अल द्वारा संशोधित 1.)
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # | टिप्पणियाँ |
| मीर Vana पैरिस किट 2X denaturing समाधान एसिड Phenol: क्लोरोफॉर्म miRNA धो समाधान 1 miRNA धो समाधान 2 / 3 | Ambion | AM1556 | संशोधित प्रोटोकॉल |
| 2 - mercaptoethanol | सिग्मा Aldrich | M7522 | |
| इथेनॉल | |||
| DEPC जल इलाज |
रासायनिक तैयार:
- 2X denaturing समाधान के लिए 2-mercaptoethanol 375 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- MiRNA धोने समाधान एक 100% इथेनॉल के 21 मिलीलीटर जोड़ें.
- MiRNA धोने समाधान 2 / 3 100% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर जोड़ें.
नमूना तैयार:
- बर्फ पर सीरम नमूना पहले गला लें.
Homogenization
- 2X denaturing समाधान के बराबर (300 μl) मात्रा (कमरे के तापमान पर होना चाहिए) और भंवर के साथ 300 μl नमूना मिक्स.
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं.
- एसिड Phenol की एक मात्रा में जोड़ें: नमूना lysate प्लस 2X denaturing समाधान (600 μl) की कुल मात्रा के बराबर क्लोरोफॉर्म.
महत्वपूर्ण: क्लोरोफॉर्म: जलीय बफर कि एसिड Phenol के शीर्ष पर स्थित का उपयोग नहीं है . - भंवर 60 सेकंड के लिए मिश्रण.
- अधिकतम गति (> +१०,००० XG) पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र. Centrifugation के बाद मिश्रण एक ऊपरी जलीय चरण, एक interphase और एक कम जैविक चरण में अलग है.
- Aque निकालेंशीर्ष पर ous परत (300 होना चाहिए - 500 μl सहित किसी भी proteinacious "धुंधला" परत).
- पुनः निकालने से पहले के रूप में फिर से क्लोरोफॉर्म जोड़कर जलीय परत.
महत्वपूर्ण: दूसरे निष्कर्षण के जलीय परत नियमित मात्रा में छोटे (250 μl) है. ध्यान दें मात्रा बरामद.
अंतिम शाही सेना अलगाव (कुल शाही सेना) की तैयारी
- पूर्व गर्मी (95 डिग्री सेल्सियस) पानी nuclease मुक्त.
- 100% इथेनॉल कमरे के तापमान पर होना चाहिए.
अंतिम शाही सेना अलगाव (कुल शाही सेना)
- बरामद जलीय चरण (जैसे अगर 300 μl बरामद किया गया, 375 μl इथेनॉल जोड़) के लिए 100% इथेनॉल 1.25 मात्रा जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- प्रत्येक नमूना के लिए, संग्रह ट्यूबों के रूप में एक फिल्टर कारतूस जगह है.
- फिल्टर पर lysate पिपेट.
- अपकेंद्रित्र (10,000 XG) 30 सेकंड के लिए प्रवाह के माध्यम से त्यागें, 30 सेकंड के लिए फिर से अपकेंद्रित्र और एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस की जगह.
आरएनए - धो
- फिल्टर और 15 सेकंड के लिए कारतूस अपकेंद्रित्र 700 μl miRNA धो एक समाधान लागू करने के लिए, संग्रह ट्यूब से प्रवाह के माध्यम से त्यागें, और एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस की जगह.
- 15 सेकंड के लिए 500 μl miRNA धो समाधान 2 / 3, अपकेंद्रित्र लागू, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक दूसरे 500 μl धो समाधान 2 / 3 के साथ दोहराएँ.
- 1-2 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से और शुष्क स्पिन त्यागें.
- प्लेस एक ताजा संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस, 100 μl मुक्त RNase पानी (95 डिग्री सेल्सियस), बंद और 2 मिनट के लिए टोपी सेते लागू होते हैं.
- ~ 2 मिनट के लिए शाही सेना की वसूली के लिए अपकेंद्रित्र.
- -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.
3. आरएनए समाधान की एकाग्रता (5X)
(निर्माण प्रोटोकॉल के बाद)
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # |
| MICROCON केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइसेज, YM-3 Ultracell | Millipore | 42404 |
| DEPC जल इलाज |
युक्ति: Microcon Ultracell YM-3, Cutoff एसएस और डी एस nucleotides: 10
वॉल्यूम: फिर से ध्यान केंद्रित आरएनए समाधान के वांछित मात्रा प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर है और नियंत्रण प्रयोगों को शामिल करना चाहिए .
- शीशी और जलाशय में पिपेट समाधान में Microcon नमूना जलाशय डालें.
नोट: झिल्ली को छूने नहीं. - 185 मिनट के लिए 4 पर अपकेंद्रित्र ° 14,000 अधिक से अधिक के साथ सी एक्स जी
नोट: रोटर की दिशा में दरार बैंड के साथ स्थिति की शीशी . - पिपेट RNase मुफ्त पानी की वांछित मात्रा (जैसे 20 μl) जलाशय पर, जगह जलाशय एक नई शीशी और 4 में 3 मिनट के लिए स्पिन में औंधा डिग्री सेल्सियस अधिकतम 3000 x जी के साथ
- -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.
4. रिवर्स प्रतिलेखन
(के बाद संशोधनों के साथ तांग एट अल द्वारा एक प्रोटोकॉल 2.)
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # | टिप्पणियाँ |
| उच्च क्षमता सीडीएनए संग्रह किट 10x सीडीएनए संग्रह बफर dNTP (100 मिमी) Moloney murine लेकिमिया वायरस (MMLV) ट्रांसक्रिपटेस (50 यू / μl) रिवर्स | एप्लाइड Biosystems | 4368814 | संशोधित प्रोटोकॉल |
| RNaseOUT (40 यू / μl) | Invitrogen | 10777019 | |
| एक्स - plex रिवर्स स्टेम पाश प्राइमर मिश्रण (40 एनएम) * | एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज | रिवाज | दृश्यों * |
| DEPC जल इलाज |
रिएक्शन वॉल्यूम: 5.5 μl
नोट: स्टेम पाश प्राइमरों के अंतिम एकाग्रता 1-5 एनएम (यहाँ 2 एनएम) होना चाहिए.
मास्टर - मिक्स प्रतिक्रिया प्रति (वॉल्यूम) तैयार निम्नानुसार:
| 1. DEPC जल | 1.959 μl |
| 2. 10x आरटी - बफर | 0.55 μl |
| 3. RNase अवरोध करनेवाला (40 यू μl /) | .0715 Μl |
| 4. dNTP (100 मिमी) | 0.275 μl |
| 5. एक्स - plex रिवर्स स्टेम पाश प्राइमर मिश्रण (40 एनएम) * | 0.275 μl |
| 6. MMLV - आर टी (50 यू / μl) | 0.369 μl |
- एम आईx और अपकेंद्रित्र संक्षिप्त.
- 2 μl नमूना 3.5 मास्टर मिक्स μl जोड़ें.
- निम्नलिखित आरटी - प्रतिक्रिया प्रदर्शन:
16 ° C 30 मिनट के लिए, 20 में 60 चक्र द्वारा पीछा ° सी 30 सेकंड के लिए, 42 ° सी 30 सेकंड के लिए, 50 ° 1 दूसरी और अंत में 85 डिग्री सेल्सियस सी के लिए 5 मिनट MMLV - आरटी, 4 निष्क्रिय डिग्री सेल्सियस ∞ . - -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करें जब तक स्टोर.
* रिवर्स स्टेम पाश प्राइमरों की सूची में पाया जा सकता http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. पूर्व प्रवर्धन (प्री - पीसीआर)
(के बाद संशोधनों के साथ तांग एट अल द्वारा एक प्रोटोकॉल 2.)
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # | टिप्पणियाँ |
| dNTP (100 मिमी) | एप्लाइड Biosystems | 4368814 | उच्च टोपी. सीडीएनए संग्रह किट. |
| 2x NoAmpErase ung के साथ यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स | एप्लाइड Biosystems | 4324018 | |
| एक्स - plex आगे प्राइमर मिश्रण (450 एनएम) * | एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज | रिवाज | दृश्यों * |
| यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर (100 सुक्ष्ममापी) | एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज | रिवाज | 2 अनुक्रम |
| AmpliTaqGold पोलीमरेज़ (5 यू / μl) | एप्लाइड Biosystems | 4311806 | |
| 2 MgCl (100 मिमी) | |||
| DEPC जल इलाज |
रिएक्शन वॉल्यूम: 27.5μl (22μl एम.एम. + 5.5μl RT उत्पाद)
नोट: पूर्व प्रवर्धन के लिए सिग्नल की शक्ति बढ़ाने के लिए आवश्यक है, खासकर जब शाही सेना के शुरू एकाग्रता सीमित है. इनपुट शाही सेना स्तर पूर्व पीसीआर चक्र के इष्टतम संख्या निर्धारित करता है. वही रिश्तेदार दक्षता को देखते हुए प्रत्येक पीसीआर चक्र अंतिम उत्पाद की एकाग्रता डबल चाहिए. चूंकि कुछ miRNAs अधिक व्यक्त अत्यधिक हो जाएगा, सायक्लिंग पर से बचें. हालांकि, के तहत प्रवर्धन का पता लगाने संवेदनशीलता का एक नुकसान में विशेष रूप से कम स्तर पर व्यक्त microRNAs के लिए, परिणाम कर सकते हैं. 12 पूर्व प्रवर्धन चक्र, कुल शाही सेना के 100ng का उपयोग कर, हमारे हाथ में पर्याप्त दिखाई दिया. शुरू सामग्री, detectable miRNA के स्तर में 12 चक्र के परिणाम है, लेकिन 15 चक्र से बेहतर होना को दिखाई के रूप में सीरम का उपयोग करना. अंत में, तीन oocytes (लगभग 400 3 oocyte प्रति स्नातकोत्तर कुल शाही सेना), 16 पूर्व प्रवर्धन चक्र के साथ शुरू सफलतापूर्वक हमें microRNA अभिव्यक्ति 4 स्तरों के लिए स्क्रीन करने की अनुमति दी.
आगे प्राइमरों * सूची में पाया जा सकता http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
मास्टर - मिक्स प्रतिक्रिया प्रति (वॉल्यूम) तैयार निम्नानुसार:
| 1. 2x यूनिवर्सल एम.एम. | 13.75 μl |
| 2. DEPC जल | 0.792 μl |
| 3. 2 MgCl (100 मिमी) | 0.55 μl |
| 4. dNTP (100 मिमी) | 1.1 μl |
| 5. एक्स - plex आगे प्राइमर मिश्रण (450 एनएम) | 3.06 μl |
| 6. यूनिवर्सल आरपी (100 सुक्ष्ममापी) | 1.375 μl |
| 7. AmpliTaqGold पोलीमरेज़ (5 यू / μl) | 1.375 μl |
- मिश्रण और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक 5.5 μl RT उत्पाद 22 μl मास्टर - मिक्स जोड़ें.
- निम्नलिखित प्रतिक्रिया प्री - पीसीआर प्रदर्शन:
95 ° सी 10 मिनट के लिए, 55 ° सी 2 मिनट के लिए, 10 से पीछा - 1 एस और 65 के लिए 95 ° C के 18 चक्रों डिग्री सेल्सियस मिनट के लिए 1, 4 डिग्री सेल्सियस ∞.
6. पूर्व-पीसीआर उत्पाद के शोधन
आकार चयन के द्वारा एक 10% देशी polyacrylamide जेल पर शोधन
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # |
| 40% Acrylamide / बीआईएस समाधान | जैव - रेड | 161-0144 |
| TEMED | जैव - रेड | 161-0801 |
| 10 बीपी डीएनए सीढ़ी | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR गोल्ड न्यूक्लिक एसिड जेल दाग DMSO में 10,000 एक्स ध्यान केंद्रित | Invitrogen | S11494 |
| ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम / एमएल) | रॉश | 10 393 001 901 |
| बफर-EB | ||
| 10% Ammoniumpersulfate (ए पी एस) | ||
| दस - बफर | ||
| 6x ऑरेंज जी | ||
| DEPC जल इलाज | ||
| ddH2O |
ए जेल तैयार
एक 10% polyacrylamide मिश्रण जोड़ने के 10ml
| 1. DDH 2 हे | 6.5 मिलीलीटर |
| 2. 10x TBE | 1 मिलीलीटर |
| 3. Polyacrylamide (40%) | 2.5 मिलीलीटर |
| 4. ए पी एस (10%) | 80 μl |
| 5. TEMED | 4 μl |
- डीएनए सीढ़ी तैयार:
- 0.5 μl 10 बीपी डीएनए सीढ़ी
- 4.5 μl बफर (EB)
- 1 μl 6x ऑरेंज जी
- प्रत्येक 27.5 μl पूर्व पीसीआर उत्पाद के 5.5 μl 6x ऑरेंज जी जोड़ें.
ज. जेल भागो
- 150V के साथ 55-60 मिनट के लिए जेल चलाएँ.
नोट: संकेतक के रूप में Bromophenol नीले रंग 20bp क्षेत्र के साथ चलाता है.
सी. जेल दाग
- SYBR गोल्ड के साथ हिलनेवाला पर 25 मिनट के लिए जेल दाग.
नोट: SYBR गोल्ड संवेदनशील प्रकाश है.
मृ जेल कट
- 60-80 बीपी से पूर्व पीसीआर उत्पाद बैंड कट और लेबल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
नोट: कम शाही सेना इनपुट पूर्व पीसीआर उत्पादों के लिए एक बैंड दिखाई नहीं हो सकता है . - जेल बैंड (ट्यूब centrifugation में जैसे ट्यूब) क्रश.
ई. पुनः निकालें सीडीएनए
- 300 μl जोड़ें - दस बफर और 37 पर सेते ° सी एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 4 घंटे के लिए.
- एक लेबल संग्रह ट्यूब द्रव स्थानांतरण, जेल युक्त ट्यूब के लिए एक और 300 दस बफर μl जोड़ने और 4 पर सभी सेते डिग्री सेल्सियस अंग को घुमानेवाली पेशी पर रातोंरात.
- शेष तरल Aspirate करने के लिए, लेबल संग्रह के रूप में पहले ट्यूब को हस्तांतरण और कुल बरामद मात्रा ध्यान दें.
एफ इथेनॉल वर्षा
- कमरे के तापमान 100% इथेनॉल के 3 खंडों में जोड़ें.
- 0.5 μl Glycogen (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
- भंवर.
- कम से कम 2 घंटे के लिए या सूखी बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
- 4 ° C में microcentrifuge में गोली सीडीएनए से 30 मिनट के लिए स्पिन.
- द्रव डंप, 700 μl कमरे के तापमान 75% और 10 मिनट के लिए इथेनॉल स्पिन जोड़ें.
- द्रव डंप और 5 मिनट के लिए फिर से स्पिन.
- 10 मिनट के लिए गोली और हवा शुष्क परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला चूसो.
- साफ पानी में गोली Redissolve.
नोट: केंद्रित सीडीएनए समाधान के वांछित मात्रा प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर है और नियंत्रण प्रयोगों को शामिल करना चाहिए.
7. पूर्व-पीसीआर उत्पाद के शोधन
प्राइमरों के enzymatic पाचन के द्वारा शुद्धीकरण (निम्नलिखित विनिर्माण प्रोटोकॉल) स्पिन स्तंभ द्वारा पीछा
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # |
| ExoSAP आईटी | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute पीसीआर शोधन किट | Qiagen | 28004 |
नोट: हमारे हाथ में अनन्य एंजाइमी साफ अप प्राइमरों सफलतापूर्वक हटा भी पूर्व प्रवर्धित उत्पाद की आंशिक गिरावट के लिए नेतृत्व, लेकिन के कारण संभवतः आंशिक कम उत्पादों के रूप में तापमान 80 ° निष्क्रियता के कदम के दौरान सी उगता denaturing एंजाइम. गर्मी निष्क्रियता से बचना और स्पिन स्तंभों का उपयोग enzymatic प्रतिक्रिया से सीधे पीसीआर उत्पादों शुद्ध उत्पाद गिरावट के बिना किसी भी किताब को हटा.
- 2 μl ExoSAP आईटी के साथ 5 μl बाद पीसीआर उत्पाद मिक्स.
- 37 में सेते ° 15 मिनट शेष प्राइमरों और nucleotides नीचा के लिए सी.
- पीसीआर प्रतिक्रिया और मिश्रण का एक मात्रा के बफर पंजाब के 5 खंडों जोड़ें पीएच सूचक अगर मैं पंजाब बफर जोड़ा गया है, जाँच लें कि मिश्रण का रंग पीला है.
- एक उपयुक्त रैक में एक एक प्रदान 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में MinElute स्तंभ रखें.
- MinElute और 1 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र नमूना लागू करें.
- प्रवाह के माध्यम से त्यागें, MinElute स्तंभ एक ही ट्यूब में वापस और जगह MinElute स्तंभ जोड़ने के लिए 750 μl बफर पीई धोने और 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- प्रवाह के माध्यम से त्यागें है और एक ही ट्यूब में MinElute स्तंभ वापस जगह. अधिकतम गति पर एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र.
- एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में MinElute स्तंभ रखें.
- डीएनए elute करने के लिए, झिल्ली के केंद्र के लिए 10 μl DEPC इलाज पानी जोड़ने के लिए, स्तंभ 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ, और फिर सदी1 मिनट के लिए trifuge.
8. Fludigim 96.96 QRT-पीसीआर रूपरेखा
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | / बिल्ली उत्पादों # | टिप्पणियाँ |
| Fluidigm 96.96 गतिशील सरणी किट 96.96 गतिशील सरणी 96.96 नियंत्रण रेखा द्रव 20x लोड हो रहा है अभिकर्मक | Fluidigm निगम | ||
| के मिक्स यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर (1 सुक्ष्ममापी) फॉरवर्ड प्राइमर (1 सुक्ष्ममापी) TaqMan जांच (0.2 सुक्ष्ममापी) | एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज | रिवाज | अनुक्रम (1) |
| 2x यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स NoAmpErase ung के साथ | एप्लाइड Biosystems | 4324018 | |
| बीच |
1. 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी भड़काना
- चिप पर accumulators के प्रत्येक में नियंत्रण रेखा द्रव (150 μl) इंजेक्षन.
- आईएफसी नियंत्रक (एकीकृत fluidic सर्किट) में प्लेस चिप और चिप में प्रधानमंत्री (136x) प्रधानमंत्री नियंत्रण रेखा तरल पदार्थ के लिए स्क्रिप्ट चलाने.
नोट: चिप पैकेज खोलने के बाद 24 घंटे में इस्तेमाल किया जा जरूरत है. करने के लिए नियंत्रण रेखा द्रव नहीं गिर के बाद से नियंत्रण चिप पर या inlets में लाइन द्रव चिप व्यर्थ बनाता है सुनिश्चित करें. चिप भड़काना के 60 मिनट के भीतर लोड की जरूरत है.
2. नमूने की तैयारी
2.1 तैयार प्री - नमूना
एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक ट्यूब में नीचे दी गई तालिका नमूना पूर्व मिक्स (इनलेट प्रति खंड) में घटक गठबंधन.
| 2x TaqMan यूनिवर्सल मास्टर मिक्स | 2.5 μl |
| 20x लोड हो रहा है अभिकर्मक | 0.25 μl |
नोट: अंतिम वॉल्यूम 2.75 μl विंदुक के लिए व्यय के रूप में नुकसान के बग़ैर
2.2 नमूना-तैयार
96 में मिश्रण अच्छी तरह से पूर्व नमूना मिश्रण (इनलेट प्रति खंड) के साथ प्रत्येक नमूने प्रारूप.
| प्री - नमूना - मिक्स | 2.75 μl |
| नमूना | 2.25 μl |
नोट: भंवर और अपकेंद्रित्र 96 अच्छी तरह से थाली संक्षेप में तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए.
इनलेट μl 5 प्रति अंतिम खंड, खाते में थोड़ा अधिक मात्रा तैयारी द्वारा नुकसान pipetting ले.
2.3 13x Assays तैयारी
- एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करने के लिए 13x assays तैयार. नीचे दी गई तालिका में 1x सांद्रता, 13x के लिए पैमाने पर.
| यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर | 1 सुक्ष्ममापी (1x) | 2 में अनुक्रम |
| फॉरवर्ड प्राइमर * | 1 सुक्ष्ममापी (1x) | * |
| जीन विशेष TaqMan जांच # | 0.2 सुक्ष्ममापी | # |
आगे प्राइमरों * सूची में पाया जा सकता http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
TaqMan जांच # की सूची में पाया जा सकता http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- एक 0.25% अंतिम बीच एकाग्रता के लिए एक नया बीच के साथ 13x assays के 96 अच्छी तरह से थाली aliquots में कम्बाइन
नोट: इनलेट प्रति अंतिम वॉल्यूम 5 μl है, पर्याप्त मात्रा (5.5 μl) मात्रा स्थानांतरण के दौरान खाते में हानि उठाने को तैयार है. - अच्छी तरह मिक्स, बुलबुले से बचने और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र के लिए तरल पदार्थ इकट्ठा.
3. चिप लोड हो रहा है
नोट: आदेश में नमूने और assays चिप की सही स्थिति सुनिश्चित करने का सही लोड करने के लिए अनुमति देने के लिए . शीर्ष बाएँ हाथ कोने पायदान संरेखित यह सुविधाजनक है.
सभी परख सुनिश्चित करें और नमूना समाधान चिप लोड करने से पहले मिश्रित कर रहे हैं. यह एक 96 अच्छी तरह से थाली में इस करते हैं और थाली चिप लोड हो रहा से पहले नीचे स्पिन करने के लिए सुविधाजनक है. बाद में संदर्भ के लिए चिप pipetting नक्शे के बारे में पता रहो.
अप्रयुक्त नमूना inlets 2.75 μl नमूना मिक्स और 2.25 μl डीएनए मुफ्त पानी से भरा जाना चाहिए.
अप्रयुक्त परख inlets 2.5 μl परख लोड हो रहा है अभिकर्मक और 2.5 μl पानी से भरा जाना चाहिए.
जबकि हवाई बुलबुले शुरू करने से बचने के pipetting पहला पड़ाव पार मत करो.
- नमूने और assays (वी लोड करने के बादइनलेट प्रति olume: μl 5) लोड मिक्स स्क्रिप्ट स्क्रिप्ट (136x) को चलाने के लिए चिप में नमूनों और assays लोड.
- स्क्रिप्ट के बाद समाप्त हो गया है, आईसीएफ नियंत्रक से चिप निकाल.
- लोड चिप के नीचे से नीले सुरक्षात्मक फिल्म पील.
- किसी भी धूल चिप सतह से कणों या मलबे निकालें.
4. 96.96 QRT - पीसीआर
- BioMark प्रणाली के लिए चिप स्थानांतरण और निम्नलिखित प्रवर्धन शर्तों का उपयोग करें:
55 ° सी के लिए 2 मिनट, 95 ° सी 10 मिनट के लिए, 15 और 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 ° C के 40 चक्र द्वारा पीछा किया. - निर्माण सॉफ्टवेयर एकत्रित डेटा के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें.
5. QPCR विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना
RT-पीसीआर के बाद मालिकाना सॉफ्टवेयर प्रवर्धन घटता, हर अच्छी तरह से गर्मी नक्शे के लिए और सीटी मूल्यों प्रदान करता है. डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर पुस्तिका को देखें.
9. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो के ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व दिखाया. मल्टीप्लेक्स QRT पीसीआर प्रोटोकॉल के एक कदम दर कदम विवरण मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन (चरण सी) और मल्टीप्लेक्स preamplification से अत्यधिक प्राइमरों की शुद्धि से पहले (चरण ई) (डी चरण) सहित, वास्तविक समय का पता लगाने, (एफ कदम) एक शुद्ध QRT-पीसीआर के लिए सीडीएनए टेम्पलेट में जिसके परिणामस्वरूप. MicroRNA विशिष्ट आगे प्राइमर, URP: सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर, आर SLP: microRNA विशिष्ट रिवर्स स्टेम पाश प्राइमर एफपी.
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चित्रा 2. QRT-पीसीआर पूर्व पीसीआर पूर्व पीसीआर उत्पाद आकार के बैंड के बाद टेम्पलेट के Polyacryamide जेल शुद्धि विशेष रूप से WT नमूनों में देखा जाता है, लेकिन नहीं microRNA कमी DGCR8 में - - / / - या पासा खेलनेवाला - नमूने (तीर) के बाद 96 plex आरटी और preamplification के 12 चक्र. ध्यान दें कि अज्ञात मूल (arrowheads) और अत्यधिक प्राइमरों के गैर विशिष्ट उत्पादों के सभी नमूनों (सितारों) में पाए जाते हैं.
चित्रा 3. मल्टीप्लेक्स preamplification बाद शोधन बेहद QRT - पीसीआर परिणाम की सटीकता में सुधार) WT mESC के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना Dgcr8 - / - (कमी विहित microRNA) mESC) 1 अधिक microRNAs का पता लगाने और 2) झूठी सकारात्मक की हानि का पता चलता है / - पृष्ठभूमि - दूर पूर्व पीसीआर उत्पाद के प्राइमरों सफ़ाई के बाद Dgcr8 में संकेत. ख) शुद्धि के बाद, DGCR8 दोनों के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर / / WT और पासा खेलनेवाला - / - / WT झूठी सकारात्मक संकेतों के एक नुकसान दिखा और दुर्लभ Dgcr8 स्वतंत्र / पासा खेलनेवाला निर्भर छोटे RNAs के उचित वर्गीकरण (मीर-320, के लिए अनुमति देते हैं - 484, -877) 5.
चित्रा 4. Fluidigm उच्च throughput miRNA रूपरेखा QRT-पीसीआर. उदाहरण स्क्रीन 96.96 Fluidigm QRT पीसीआर mircoRNA रूपरेखा के प्रोस्टेट कैंसर रोगी सीरा के miRNA के स्तर में परिवर्तन के लिए स्क्रीन के लिए गोली मार दी. वास्तविक समय qPCR विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवर्धन घटता, रंग कोडित नक्शे गर्मी चक्र और दहलीज (सीटी) प्रदान करता है.
Discussion
miRNAs कम कर रहे हैं (18-24 न्यूक्लीओटाइड्स), गैर कोडन RNAs, जो दोनों को अस्थिर दूत (mRNA) RNAs और बाधा उनके अनुवाद के द्वारा जीन अभिव्यक्ति के बाद transcriptionally विनियमित 6. तथ्य यह है कि कम से कम मानव जीन की एक तिहाई संरक्षित होते miRNA उनके 3'UTR में बाध्यकारी साइटों और स्पष्ट बातचीत pluripotency, प्रसार, और apoptosis के लिए जीन के साथ miRNAs की सेल भाग्य का निर्णय, ऊतक homeostasis और कैंसर जैसे रोगों में एक महत्वपूर्ण योगदान पता चलता है 6,7 इसलिए सटीक microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल व्यापक हैं ब्याज.
प्रकाशित QRT-पीसीआर miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा 2 प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स का परीक्षण करने के लिए हम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में छोटे आरएनए कमी mESC इस्तेमाल किया. DGCR8 - / - कोशिकाओं विहित सभी microRNAs की कमी कर रहे हैं, जबकि पासा खेलनेवाला - / - कोशिकाओं दोनों विहित और गैर canoncial micoRNAs कमी 8,9
/ - - DGCR8 संदेश जंगली प्रकार में स्तर की तुलना कोशिकाओं, हम के रूप में कई व्यक्त 10 microRNAs जंगली प्रकार 11 कोशिकाओं में नहीं पाया गया सटीकता की कमी खुला. कुछ भी कम अभिव्यक्ति के स्तर को पीटकर कोशिकाओं (चित्र 3a) के सापेक्ष दिखाया. हम धारणा है कि सटीकता की कमी लगातार दो मल्टीप्लेक्स कदम के बड़े पैमाने पर ले singleplex आरटी - मात्रा का ठहराव पहले प्राइमर (आरटी और प्री - पीसीआर) की वजह से हो सकता है. हालांकि, मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन पूर्व सिग्नल की शक्ति को बढ़ाने के लिए आवश्यक है, खासकर जब शाही सेना के शुरू एकाग्रता सीमित है. / - - दूर देशी polyacrylamide जैल (चित्रा 2) पर आकार चयन द्वारा प्राइमरों से पूर्व पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करके, हम अधिक microRNAs और Dgcr8 दोनों में झूठी सकारात्मक संकेतों का एक नुकसान का पता लगाने के द्वारा सटीकता में पर्याप्त सुधार का प्रदर्शन कर सकता और पासा खेलनेवाला / - इसके अलावा पृष्ठभूमि (आंकड़े 3a और 3b) संशोधित QRT-पीसीआर दुर्लभ Dgcr8 स्वतंत्र / पासा खेलनेवाला निर्भर छोटे (चित्रा 3b) RNAs 11 की उचित वर्गीकरण के लिए अनुमति दी दृष्टिकोण. इसलिए एक अतिरिक्त कदम अत्यधिक प्राइमरों शुद्ध पूर्व पीसीआर उत्पाद से दूर स्पष्ट रूप से फायदेमंद है, खासकर जब बड़े मल्टीप्लेक्स प्राइमर का उपयोग नमूना प्रति सेट.
पूर्व प्रवर्धन चक्र के इष्टतम संख्या इनपुट शाही सेना सांद्रता के द्वारा निर्धारित किया जाता है. नहीं अंतर्गत या संतुलन overamplify विशिष्ट प्रयोग के विवरण के द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए.
एक हजार से अधिक जाना जाता microRNAs के साथ, मानक के उपयोग 384 अच्छी तरह प्लेटें व्यापक microRNA रूपरेखा के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है, खासकर जब कई नमूने की तुलना कर सकते हैं. Fluidigm गतिशील ऐरे आईएफसी pipetting कदम और जरूरत रसायन शास्त्र की एक महत्वपूर्ण कमी के साथ सक्षम बनाता है, nanoliter पैमाने (6.7 NL) पर एक ही प्रयोग (9216 प्रतिक्रियाओं) में 96 विभिन्न microRNAs के खिलाफ 96 व्यक्ति नमूने के परीक्षण है. प्रत्येक रन के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवर्धन घटता, रंग कोडित नक्शे गर्मी चक्र और दहलीज मूल्यों (सीटी) प्रदान करता है. एक साथ बड़े पैमाने पर की रूपरेखा प्रयोगात्मक प्रसरण कम कर देता है और मतलब अभिव्यक्ति मूल्य सामान्य है, जो अन्य सामान्य रणनीति है कि छोटे आरएनए नियंत्रण का उपयोग कर बाहर प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है 12.
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व सौंपा TaqMan जांच के साथ 384 अच्छी तरह प्लेटफार्मों की तुलना में, कस्टम बनाया प्राइमर सेट के साथ एक उच्च throughput रूपरेखा मंच के संयोजन उच्च प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है.
गतिशील ऐरे प्लेटफार्म के साथ अनुकूलित QRT-पीसीआर मल्टीप्लेक्स संयोजन में दृष्टिकोण सफलतापूर्वक हमें परिवर्तन के लिए एक साथ 384 miRNA (चित्रा 4) के स्तर में 48 प्रोस्टेट कैंसर के रोगी सीरा और स्क्रीन नियंत्रण में स्पाइक (यानी कृत्रिम microRNAs) के बिना डेटा को सामान्य करने की अनुमति दी. 11
नमूने की तैयारी से रूपरेखा परिणाम के लिए कदम की वृद्धि के बावजूद, वर्णित दृष्टिकोण एक समय और लागत प्रभावी उच्च throughput विधि miRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए बड़े नमूना सेट प्रोफ़ाइल सीमित शुरू सामग्री के साथ भी है.
Disclosures
एलन मीर Fluidigm निगम के एक कर्मचारी है. अन्यथा, हम खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय हितों है.
Acknowledgments
हम Blelloch प्रयोगशाला पाठ पर टिप्पणी करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम (NS48118 K08 और NS057221 R01) एनआईएच, पुनर्योजी चिकित्सा के कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) (बीज RS1 00,161 अनुदान, नई संकाय पुरस्कार RN2 - 00,906) और बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट से आरबी के लिए धन और एफएम से समर्थित किया गया Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
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