Summary
نحن هنا تصف عكس متعددة الأمثل المنتسخة PCR الكمي (qRT - PCR) بروتوكول بالاشتراك مع منصة ميكروفلويديك من حيث التكلفة والوقت أداة فعالة الفرز الفائق الإنتاجية للmicroRNA (ميرنا) مستويات التعبير ، وخاصة عند العمل مع كميات محدودة من العينة.
Abstract
وقد أدى تدخل واسع من العمليات الحرجة في miRNAs الكامنة التنمية ، والأنسجة homoeostasis المرض إلى اهتمام المتزايد بين المجتمعات والبحوث الدوائية. لدراسة miRNAs ، فمن الضروري أن القياس الكمي لمستويات microRNA دقيقة وقوية. بمقارنة البرية من نوع خلايا الحمض النووي الريبي للمشاريع الصغيرة الجذعية الجنينية ناقصة (مسك) ، وكشف لنا عدم وجود دقة ومتانة في السابق نشر تقنيات متعددة qRT - PCR. هنا ، نحن تصف أسلوب الأمثل ، بما في ذلك تنقية بعيدا الاشعال المفرط من الخطوات السابقة قبل الكشف المتعدد singleplex الوقت الحقيقي ، مما يزيد بشكل كبير من دقة ومتانة الأسلوب. علاوة على ذلك ، يمكننا أن نفسر كيف يؤدون هذه التقنية على رقاقة ميكروفلويديك في أحجام نانولتر يقلل كثيرا من تكاليف كاشف وسمح الوقت فعالة ميرنا إنتاجية عالية التنميط التعبير.
Protocol
1. RNA - الاستخراج : الخلايا المزروعة في المونولاير
(وبعد بروتوكول الشركة المصنعة باستخدام TRIzol).
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # |
| TRIzol الحل | Invitrogen | 15596-018 |
| ايزوبروبيل | سيغما الدريخ | 1907-1964 |
| كلوروفورم | سيغما الدريخ | C 2432 |
| الإيثانول | ||
| ريبونوكلياز المياه مجانا |
التجانس
- التجانس الخلايا مباشرة على طبق الثقافة عن طريق إضافة 1 مل من محلول Trizol بنسبة 10 سم منطقة صحن 2 ، دوامة Trizol حول وماصة صعودا وهبوطا لضمان التغطية الكاملة للوحة.
مرحلة فصل
- احتضان العينة متجانسة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل في أنبوب المسمى ، إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم في 1ml TrizolSolution ويهز بقوة أنبوب باليد لمدة 15 ثانية.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة في 2 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي الخليط يفصل في مرحلة أقل الأحمر ، ويقدم عرضا الطور البيني عديم اللون المائي المرحلة العليا ، والتي تحتوي على الحمض النووي الريبي ، وينبغي أن يكون 60 ٪ من حجم Trizol الحل الكلي.
RNA الأمطار
- نقل مائي ، التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المرحلة في أنبوب ، طازجة وصفت.
- ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل في 1 مل من محلول Trizol.
- احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة في 2 درجة مئوية.
RNA غسل
- بعد الطرد المركزي ، وتجاهل طاف من الأنابيب.
- غسل بيليه الحمض النووي الريبي (وعلى الجانب السفلي من الأنبوب) وذلك بإضافة ما لا يقل عن 1 مل من الإيثانول بنسبة 75 ٪ لكل 1 مل من محلول Trizol ، الدوامة.
- الطرد المركزي في 7500 XG لمدة 5 دقائق في 2 درجة مئوية.
RNA شطف
- تجاهل طاف وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. إزالة السوائل الزائدة.
- الهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقائق.
ملاحظة : أكثر من الحمض النووي الريبي المجففة من الصعب solubilize. - Redissolve الكرية في الماء ريبونوكلياز مجانا من pipetting الحل أعلى ولأسفل واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي (نسبة A260/280) باستخدام معمل ™ Nanodrop.
- المحل في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
2. RNA - الاستخراج : مصل
(بروتوكول عقب mirVana الصانع كيت باريس تعديلها من قبل ميتشل وآخرون 1)
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # | تعليقات |
| مير فانا باريس كيت 2X تغيير طبيعة الحل حمض الفينول : الكلوروفورم ميرنا الحل اغسل 1 ميرنا الحل اغسل 03/02 | Ambion | AM1556 | تعديل البروتوكول |
| 2 - المركابتويثانول | سيغما الدريخ | M7522 | |
| الإيثانول | |||
| المياه المعالجة DEPC |
الكيميائية التحضير :
- تضيف 375 ميكرولتر من المركابتويثانول - 2 وصولا الى الحل 2X تغيير طبيعة وتخلط جيدا.
- إضافة 21 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ لميرنا الحل يغسل 1.
- إضافة 40 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ في محلول غسل ميرنا 2 / 3.
عينة التحضير :
- أذاب عينة مصل على الجليد.
التجانس
- مزيج 300 عينة ميكرولتر مع حجم مساو (300 ميكرولتر) من تغيير طبيعة الحل 2X (يجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة) ودوامة.
- احتضان الخليط على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة حجم الفينول ، حمض : الكلوروفورم مساويا لمجموع حجم العينة في lysate بالإضافة إلى تغيير طبيعة الحل 2X (600 ميكرولتر).
هام : عدم استخدام المنطقة العازلة المائية التي تقع على أعلى من الفينول ، حمض : الكلوروفورم. - خليط دوامة لمدة 60 ثانية.
- أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في السرعة القصوى (> XG 10000). بعد الطرد المركزي الخليط يفصل في المرحلة مائي العلوي ، والطور البيني ويقدم عرضا أقل المرحلة العضوية.
- إزالة aqueالأوس على أعلى طبقة (ينبغي 300-500 ميكرولتر بما في ذلك أي proteinacious طبقة "ضبابي").
- إعادة استخراج طبقة المائية كما كان من قبل من خلال إضافة ثانية الكلوروفورم.
المهم : الطبقة المائية للاستخلاص الثاني هو أصغر في الحجم بشكل روتيني (250 ميكرولتر). لاحظ حجم استردادها.
إعداد والعزل النهائي RNA (RNA الكل)
- قبل الحرارة (95 درجة مئوية) nuclease خالية من المياه.
- يجب أن يكون الإيثانول بنسبة 100 ٪ في درجة حرارة الغرفة.
والعزل النهائي RNA (RNA الكل)
- إضافة 1.25 حجم الإيثانول بنسبة 100 ٪ على المرحلة مائي المستردة (على سبيل المثال إذا تم استرداد 300 ميكرولتر ، إضافة الإيثانول 375 ميكرولتر) وتخلط جيدا.
- لكل عينة ، ضع خرطوشة مرشح الى واحد من أنابيب جمع.
- ماصة للlysate على المرشح.
- الطرد المركزي (10،000 XG) لمدة 30 ثانية ، وتجاهل التدفق من خلال الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 ثانية ، واستبدال خرطوشة مرشح في أنبوب نفس المجموعة.
RNA - اغسل
- تطبيق 700 تغسل ميرنا ميكرولتر الحل 1 إلى التصفية والطرد المركزي خرطوشة لمدة 15 ثانية ، وتجاهل من التدفق من خلال أنبوب الجمع ، واستبدال خرطوشة مرشح في أنبوب نفس المجموعة.
- تطبيق 500 تغسل ميرنا ميكرولتر الحل 2 / 3 ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية ، وتجاهل التدفق من خلال وكرر مع 500 ميكرولتر الثاني من محلول الغسيل 2 / 3.
- تجاهل التدفق من خلال زيادة ونقصان والجافة لمدة 1-2 دقائق.
- خرطوشة تصفية مكان في أنبوب جمع جديدة ، وتطبيق 100 ميكرولتر المياه مجانا ريبونوكلياز (95 درجة مئوية) ، وكأب وثيقة واحتضان لمدة 2 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لدقائق 2 ~ لاسترداد رنا.
- المحل في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تركيز الحمض النووي الريبي ، محلول (5X)
(في أعقاب بروتوكول لصنع)
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # |
| أجهزة الطرد المركزي تصفية MICROCON ، Ultracell YM - 3 | ميليبور | 42404 |
| المياه المعالجة DEPC |
الجهاز : Microcon Ultracell YM - 3 ، SS القطع والنكليوتيدات DS : 10
حجم التداول : حجم المطلوب من حل RNA إعادة مركزة تعتمد على التصميم التجريبي وينبغي أن تتضمن التجارب السيطرة.
- إدراج Microcon خزان العينة إلى القارورة وحل ماصة في الخزان.
ملاحظة : لا تلمس الغشاء. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 185 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 14000 القصوى س ز
ملاحظة : ضع قارورة مع الفرقة الكراك نحو الدوار. - ماصة حجم المطلوب من المياه المجانية ريبونوكلياز (على سبيل المثال 20 ميكرولتر) على الخزان ، خزان مكان المقلوب في قارورة جديدة وزيادة ونقصان لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية مع القصوى ز × 3000
- المحل في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. عكس النسخ
(بعد بواسطة بروتوكول تانغ وآخرون 2 مع ادخال تعديلات عليها.)
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # | تعليقات |
| طقم عالية القدرة أرشيف [كدنا] [كدنا] 10X الاحتياطي الأرشفة dNTP (100 ملم) مولوني فيروس ابيضاض الدم الفأري (MMLV) عكس المنتسخة (50 U / ميكرولتر) | تطبيق النظم البيولوجية | 4368814 | تعديل البروتوكول |
| RNaseOUT (40 U / ميكرولتر) | Invitrogen | 10777019 | |
| س نوع plex مزيج عكس التمهيدي الجذعية حلقة (40 نانومتر) * | المتكاملة للتقنيات الحمض النووي | عرف | متواليات * |
| المياه المعالجة DEPC |
حجم رد الفعل : 5.5 ميكروليتر
ملاحظة : التركيز النهائي للالاشعال الجذعية حلقة ينبغي 1-5 نانومتر (هنا 2 نانومتر).
تحضير ماجستير ميكس (وحدات التخزين في رد فعل) على النحو التالي :
| 1. DEPC للمياه | 1،959 ميكرولتر |
| 2. RT - 10X العازلة | 0.55 ميكرولتر |
| 3. ريبونوكلياز المانع (40 U / ميكرولتر) | 0.0715 ميكرولتر |
| 4. dNTP (100 ملم) | 0،275 ميكرولتر |
| 5. س نوع plex مزيج عكس التمهيدي الجذعية حلقة (40 نانومتر) * | 0،275 ميكرولتر |
| 6. MMLV - RT (50 U / ميكرولتر) | 0،369 ميكرولتر |
- ميx و لفترة وجيزة الطرد المركزي.
- إضافة 3.5 ميكرولتر ماجستير ميكس العينة إلى 2 ميكرولتر.
- نفذ ما يلي RT الرد :
16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها 60 دورة في 20 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 1 ثانية و 85 درجة مئوية في نهاية المطاف لمدة 5 دقائق لتعطيل MMLV - RT ، 4 درجات مئوية ∞ . - تخزين -20 درجة مئوية في حين استخدامها.
* يمكن الاطلاع على قائمة الاشعال الجذعية حلقة في عكس http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. قبل التضخيم (قبل PCR)
(بعد بواسطة بروتوكول تانغ وآخرون 2 مع ادخال تعديلات عليها.)
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # | تعليقات |
| dNTP (100 ملم) | تطبيق النظم البيولوجية | 4368814 | ارتفاع سقف. [كدنا] أرشيف كيت. |
| 2X العالمي ميكس ماجستير PCR مع أونغ NoAmpErase | تطبيق النظم البيولوجية | 4324018 | |
| س نوع plex مزيج التمهيدي قدما (450 نانومتر) * | المتكاملة للتقنيات الحمض النووي | عرف | متواليات * |
| عكس التمهيدي العالمي (100 ميكرومتر) | المتكاملة للتقنيات الحمض النووي | عرف | تسلسل 2 |
| AmpliTaqGold بوليميريز (5 U / ميكرولتر) | تطبيق النظم البيولوجية | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 ملم) | |||
| المياه المعالجة DEPC |
حجم رد الفعل : 27.5μl (MM 22μl + 5.5μl RT - المنتج)
ملاحظة : قبل التضخيم ضروري لتحسين قوة الإشارة ، وخصوصا عندما يقتصر تركيز بدءا من الحمض النووي الريبي. مستوى إدخال الحمض النووي الريبي يحدد العدد الأمثل من قبل PCR دورات. نظرا بنفس الكفاءة النسبية ينبغي لكل دورة PCR ضعف التركيز للمنتج النهائي. منذ بعض miRNAs ستكون أكثر عالية وأعرب ، خلال تجنب ركوب الدراجات. ومع ذلك ، يمكن دون التضخيم يؤدي إلى فقدان للحساسية الكشف ، وخاصة بالنسبة للmicroRNAs التي أعرب عنها في مستويات منخفضة. في أيدينا بدا قبل 12 دورات التضخيم ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي 100ng من المجموع ، كافية. استخدام المصل كمادة انطلاق ، 12 دورات النتائج في مستويات ميرنا كشف ، ولكن 15 دورات يبدو أن متفوقة. أخيرا ، بدءا من 3 البويضات (RNA نحو 400 خريج الكلية لكل بويضة 3) ، 16 قبل التضخيم دورات يسمح لنا بنجاح للكشف عن مستويات التعبير microRNA 4.
* يمكن الاطلاع على قائمة الاشعال قدما في http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
تحضير ماجستير ميكس (وحدات التخزين في رد فعل) على النحو التالي :
| 1. 2X العالمي MM | 13.75 ميكرولتر |
| 2. DEPC للمياه | 0،792 ميكرولتر |
| 3. MgCl 2 (100 ملم) | 0.55 ميكرولتر |
| 4. dNTP (100 ملم) | 1.1 ميكرولتر |
| 5. س نوع plex مزيج التمهيدي قدما (450 نانومتر) | 3.06 ميكرولتر |
| 6. RP عالمية (100 ميكرومتر) | ميكرولتر 1،375 |
| 7. AmpliTaqGold بوليميريز (5 U / ميكرولتر) | ميكرولتر 1،375 |
- خلط وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
- إضافة 22 ميكرولتر ماجستير ميكس لكل ميكرولتر RT - 5.5 المنتج.
- نفذ ما يلي قبل تفاعل PCR :
95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 10-18 دورات درجة مئوية لمدة 1 ق 95 و 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 4 درجات مئوية ∞.
6. تنقية المنتج قبل PCR
تنقية عن طريق اختيار حجم هلام بولي أكريلاميد على الأم 10 ٪
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # |
| 40 ٪ الأكريلاميد / الحل مكرر | الحيوي راد | 161-0144 |
| TEMED | الحيوي راد | 161-0801 |
| 10 سلم غليان الحمض النووي | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR الذهب هلام حمض النووي وصمة عار 10000 X التركيز في DMSO | Invitrogen | S11494 |
| الجليكوجين (20 ملغ / مل) | روش | 10 901 393 001 |
| EB - العازلة | ||
| 10 ٪ Ammoniumpersulfate (APS) | ||
| عشر الاحتياطي | ||
| 6X البرتقالية G | ||
| المياه المعالجة DEPC | ||
| ddH2O |
أ. تحضير هلام
لجعل 10ML من مزيج بولي أكريلاميد 10 ٪ إضافة
| 1. DDH 2 O | 6.5 مل |
| 2. 10X TBE | 1 مل |
| 3. بولي أكريلاميد (40 ٪) | 2.5 مل |
| 4. وكالة الأنباء الجزائرية (10 ٪) | 80 ميكرولتر |
| 5. TEMED | 4 ميكرولتر |
- إعداد سلم الحمض النووي :
- 0.5 ميكرولتر غليان الحمض النووي سلما 10
- 4.5 ميكرولتر العازلة (EB)
- 1 ميكرولتر 6X البرتقالية G
- إضافة 5.5 ميكرولتر G أورانج 6X إلى 27.5 لكل منتج قبل PCR ميكرولتر.
ب. تشغيل جل
- تشغيل جل مع ل150V 55-60 دقيقة.
ملاحظة : الزرقاء Bromophenol كمؤشر يعمل مع 20bp المنطقة.
ج. جل وصمة عار
- وصمة عار مع هلام SYBR الذهب لمدة 25 دقيقة على شاكر.
ملاحظة : SYBR الذهب خفيف الحساسة.
د. قطع جل
- قطع تمهيدي PCR الفرقة المنتج 60-80 سنة مضت ، ونقل إلى أنبوب المسمى.
ملاحظة : النطاق لمنتجات منخفضة قبل RNA - PCR الإدخال قد لا تكون مرئية. - سحق عصابة هلام (على سبيل المثال في أنبوب أنبوب الطرد المركزي).
ه. إعادة استخراج [كدنا]
- إضافة 300 ميكرولتر عشر الاحتياطي واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على محور دوار.
- نقل السوائل إلى أنبوب جمع المسمى ، إضافة آخر ميكرولتر 300 - TEN العازلة للأنابيب المحتوية على الجل واحتضان جميع في 4 درجات مئوية خلال الليل على محور دوار.
- نضح السوائل المتبقية ، ونقل إلى أنبوب جمع المسمى كما كان من قبل ونلاحظ أن إجمالي حجم استردادها.
ف. الإيثانول الأمطار
- إضافة 3 مجلدات من الايثانول درجة حرارة الغرفة 100 ٪.
- إضافة 0.5 ميكرولتر الجليكوجين (20 ملغ / مل).
- الدوامة.
- احتضان على الجليد الجاف لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو على -80 درجة مئوية خلال الليل.
- تدور في microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتكوير [كدنا].
- تفريغ السائل ، إضافة درجة حرارة الغرفة 700 ميكرولتر الإيثانول 75 ٪ وزيادة ونقصان لمدة 10 دقيقة.
- تفريغ السوائل وتدور مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
- تمتص قبالة طاف بيليه من دون إزعاج والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
- Redissolve الكرية في المياه النظيفة.
ملاحظة : حجم المطلوب من الحل [كدنا] تتركز تعتمد على التصميم التجريبي وينبغي أن تتضمن التجارب السيطرة.
7. تنقية المنتج قبل PCR
ثم تنقية بواسطة الهضم الأنزيمي من المشارع التي تدور العمود (البروتوكولات التالية المصنوعات)
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # |
| ExoSAP - IT | USB - Affymetrix | 78250 |
| MinElute أدوات تنقية PCR | Qiagen | 28004 |
ملاحظة : في أيدينا ولكنه أدى أيضا الحصري الأنزيمية تنظيف بنجاح إزالة الاشعال إلى تدهور جزئي للمنتج قبل تضخيمها ، وربما بسبب تغيير طبيعة جزئية للمنتجات قصيرة كما ترتفع درجة الحرارة تصل إلى 80 درجة مئوية خلال خطوة لتعطيل الانزيم. تجنب تعطيل الحرارة وتنقية المنتجات مباشرة من تفاعل PCR الأنزيمية باستخدام الأعمدة تدور يزيل أي التمهيدي دون تدهور المنتج.
- مزيج 5 ميكرولتر بعد PCR المنتج مع 2 ميكرولتر IT - ExoSAP.
- احتضان في 37 لمدة 15 دقيقة للحط من الاشعال المتبقية والنيوكليوتيدات درجة مئوية.
- إضافة 5 مجلدات من الاحتياطي إلى 1 PB حجم رد الفعل ومزيج PCR ، إذا كان مؤشر الرقم الهيدروجيني وقد اضفت الى الاحتياطي الجريدة الرسمية ، وتأكد من أن لون الخليط أصفر.
- مكان عمود MinElute في المقدمة 2 مل أنبوب جمع في رفوف مناسبة.
- تطبيق نموذج لعمود MinElute وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة.
- التدفق من خلال تجاهل ومكان العمود MinElute مرة أخرى إلى الأنبوب نفسه وإضافة 750 ميكرولتر PE الاحتياطي إلى العمود MinElute لغسل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة.
- التدفق من خلال تجاهل ومكان العمود الخلفي MinElute في الأنبوب نفسه. الطرد المركزي للحصول على العمود 1 دقيقة إضافية في أقصى سرعة.
- مكان العمود MinElute في تنظيف الأنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- وأزل الحمض النووي ، وإضافة 10 ميكرولتر DEPC المياه المعالجة الى مركز للغشاء ، والسماح للعمود الوقوف لمدة 1 دقيقة ، ثم سtrifuge لمدة 1 دقيقة.
8. Fludigim qRT 96.96 - PCR التنميط
| اسم كاشف | شركة | همز / القط # | تعليقات |
| Fluidigm 96.96 كيت صفيف الحيوي 96.96 صفيف حيوية 96.96 السائل خط السيطرة 20X تحميل الكاشف | Fluidigm مؤسسة | ||
| مزيج من عالمية التمهيدي عكسي (1 ميكرون) إلى الأمام التمهيدي (1 ميكرون) TaqMan دقق (0.2 ميكرومتر) | المتكاملة للتقنيات الحمض النووي | عرف | تسلسل (1) |
| 2X العالمي PCR ماجستير ميكس مع أونغ NoAmpErase | تطبيق النظم البيولوجية | 4324018 | |
| توين |
1. مؤسسة التمويل الدولية في فتيلة 96.96 صفيف الحيوي
- حقن السائل خط السيطرة (150 ميكرولتر) في كل من مدخرات على الرقاقة.
- رقاقة تحكم في مكان (متكامل fluidic الدائرة) مؤسسة التمويل الدولية وتشغيل (136x) رئيس الوزراء النصي لمراقبة خط السائل إلى الرقاقة.
ملاحظة : المعالج يحتاج إلى أن تستخدم بعد 24 ساعة من فتح العبوة. تأكد من عدم تسرب السائل خط السيطرة منذ سيطرة خط السائل على شريحة أو في مداخل يجعل شريحة غير صالحة للاستعمال. رقاقة يحتاج إلى أن يتم تحميل في غضون 60 دقيقة من فتيلة.
2. تحضير العينات
2.1 تمهيدي تحضير العينة
في أنبوب من البلاستيك القابل للتصرف ، والجمع بين العناصر في الجدول أدناه لجعل عينة قبل ميكس (وحدات التخزين في مدخل).
| 2X TaqMan العالمي ماجستير ميكس | 2.5 ميكرولتر |
| 20X تحميل الكاشف | 0.25 ميكرولتر |
ملاحظة : الحجم النهائي هو 2.75 ميكروليتر ، والفائض عن الاستغناء عن الخسائر ماصة
2.2 - إعداد نموذج
تجمع في 96 تنسيق جيد مع كل عينة ما قبل عينة مزيج (وحدات التخزين في مدخل).
| قبل العينة ميكس | 2.75 ميكرولتر |
| عينة | 2.25 ميكرولتر |
ملاحظة : دوامة الطرد المركزي وكذلك 96 لوحة لفترة وجيزة لجمع السائل.
الحجم النهائي لكل ميكرولتر مدخل 5 ، تأخذ في الاعتبار فقدان pipetting من خلال إعداد حجم أكبر قليلا.
2.3 إعداد فحوصات 13x
- 96 استخدام لوحة جيدة لإعداد المقايسات 13x. 1X تركيزات في الجدول أدناه ، من أجل رفع مستوى 13x.
| عكس التمهيدي العالمي | 1 ميكرومتر (1X) | تسلسل 2 |
| إلى الأمام التمهيدي * | 1 ميكرومتر (1X) | * |
| جينات محددة TaqMan دقق # | 0.2 ميكرومتر | # |
* يمكن الاطلاع على قائمة الاشعال قدما في http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
ويمكن الاطلاع على قائمة # مجسات TaqMan في http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- تجمع جديد في 96 لوحة aliquots جيدا المقايسات 13x مع توين عن تركيز توين النهائي 0.25 ٪
ملاحظة : الحجم النهائي هو 5 في مدخل ميكرولتر ، وإعداد حجم كاف (5.5 ميكرولتر) لاتخاذ خسارة أثناء نقل الصوت بعين الاعتبار. - مزيج جيد ، وتجنب فقاعات وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل.
3. تحميل رقاقة
ملاحظة : من أجل السماح لتحميل تصحيح العينات والمقايسات ضمان تحديد المواقع الصحيحة من الرقاقة. وهو ملائمة لتحقيق المواءمة بين الشق إلى الزاوية اليسرى العليا.
التأكد من أن كل فحص وحلول عينة مختلطة قبل تحميل الشريحة. وهو ملائمة للقيام بذلك في 96 لوحة وكذلك زيادة ونقصان لوحة أسفل قبل تحميل الشريحة. يكون على بينة من خارطة رقاقة pipetting كمرجع لاحق.
وينبغي سد المنافذ غير المستخدمة مع عينة ميكس 2.75 و 2.25 ميكرولتر عينة الحمض النووي ميكرولتر المياه مجانا.
وينبغي سد المنافذ غير المستخدمة مقايسة مع 2.5 ميكرولتر مقايسة كاشف تحميل و 2.5 ميكرولتر المياه.
لا تذهب الماضي المحطة الاولى في حين pipetting لتجنب إدخال فقاعات الهواء.
- بعد تحميل العينات والمقايسات (Volume لكل مدخل : 5 ميكرولتر) تشغيل البرنامج النصي تحميل ميكس (136x) النصي لتحميل العينات والمقايسات إلى الرقاقة.
- بعد انتهاء البرنامج النصي ، إزالة الشريحة من وحدة تحكم ICF.
- قشر الفيلم واقية زرقاء من الجانب السفلي من الشريحة تحميلها.
- إزالة أي جزيئات الغبار أو الحطام من على سطح الرقاقة.
4. qRT 96.96 - PCR
- نقل الشريحة إلى النظام واستخدام BioMark بعد التضخيم الشروط :
55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. - متابعة بروتوكول لتصنيع جمع البيانات البرمجيات.
5. باستخدام برنامج التحليل qPCR
بعد RT - PCR والبرمجيات الاحتكارية يوفر منحنيات التضخيم ، وخرائط الحرارة والقيم ط م لكل بئر. يرجى الرجوع إلى دليل البرمجيات لتحليل البيانات.
9. ممثل النتائج :
الشكل 1. تمثيل بياني لسير العمل التجريبية. ظاهر هو وصف خطوة بخطوة للبروتوكول qRT - PCR متعددة ، بما في ذلك تنقية (E الخطوة) من الاشعال المفرط من عكس النسخ المتعدد (الخطوة C) وpreamplification متعددة (الخطوة D) قبل الكشف عن الوقت الحقيقي (الخطوة F) ، مما أدى إلى قالب [كدنا] لتنقية qRT - PCR. FP : microRNA التمهيدي قدما محددة ، URP : عالمي التمهيدي العكسي ، R - SLP : microRNA محددة عكس الجذعية حلقة التمهيدي.
انقر هنا للحصول على صورة أكبر.
الشكل 2. وينظر حصرا Polyacryamide تنقية هلام من القالب qRT - PCR بعد البولنجر قبل PCR من حجم المنتج قبل PCR في عينات WT ، ولكن ليس في DGCR8 microRNA ناقصة -- / -- أو المقامر -- / -- بعد العينات (سهام) 96 نوع plex RT و 12 دورات preamplification. لاحظ أن يتم العثور على غير محددة من المنتجات مجهولة المنشأ (السهام) والشعائل المفرطة في جميع العينات (نجوم).
الشكل 3. بعد تنقية preamplification متعددة يحسن كثيرا من دقة qRT - PCR نتائج المقارنة) من مستويات التعبير النسبية لمسك WT Dgcr8 -- / -- (ناقص microRNA الكنسي) مسك يكشف 1) الكشف عن مزيد من microRNAs و 2) خسارة إيجابية كاذبة إشارات في Dgcr8 -- / -- الخلفيات بعد تنقية بعيدا الاشعال للمنتج قبل PCR. ب) بعد تنقيتها ، ومستويات التعبير النسبية لكلا DGCR8 -- / -- / WT والمقامر -- / -- / WT تظهر فقدان اشارات ايجابية كاذبة ، والسماح للتصنيف السليم نادرة Dgcr8 الرناوات المستقل / المقامر الصغيرة التابعة (مير 320 ، -- 484 ، -877) 5
الشكل 4. Fluidigm عالية الإنتاجية التنميط ميرنا qRT - PCR. مثال قطة شاشة 96.96 Fluidigm التنميط mircoRNA qRT - PCR للكشف عن تغيير في مستويات ميرنا من سرطان البروستاتا الأمصال المريض. تحليل qPCR في الوقت الحقيقي ويوفر البرنامج منحنيات التضخيم ، وخرائط الحرارة مرمزة وعتبة دورة (CT).
Discussion
miRNAs قصيرة (18-24 النيوكليوتيدات) ، غير الترميز RNAs وميرنا ، التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally من قبل كل من الرنا الرسول زعزعة الاستقرار (مرنا) ، وتحول دون ترجمتها. 6 وحقيقة أن ما لا يقل عن ثلث الجينات البشرية تحتوي على الحفظ ملزمة مواقع في 3'UTR والتفاعل واضحا من miRNAs مع الجينات للانتشار ، وموت الخلايا المبرمج تعدد القدرات تقترح مساهمة حاسمة في اتخاذ القرارات مصير الخلية ، الأنسجة والتوازن أمراض مثل السرطان. microRNA التعبير 6،7 دقيقة لذلك هي الملامح العريضة الفائدة.
لاختبار متعددة نشرت qRT - PCR التنميط التعبير بروتوكول ميرنا 2 استخدمنا الصغيرة RNA MESC أنها مقصرة ضوابط السلبية. DGCR8 -- / -- تعاني من نقص خلايا جميع microRNAs الكنسي ، في حين أن المقامر -- / -- نقص خلايا micoRNAs الكنسي على حد سواء وعدم canoncial - 8،9
مقارنة مستويات في نوع البرية MES إلى DGCR8 -- / -- الخلايا ، وكشف لنا عدم وجود دقة وأعرب عن عدة لم يتم اكتشاف 10 microRNAs في الخلايا البرية من نوع 11. وأظهرت بعض حتى انخفاض مستويات التعبير النسبي للخلايا خروج المغلوب (الشكل 3A). افترضنا أنه قد يكون السبب في عدم مراعاة الدقة من قبل التمهيدي ضخمة تحمل أكثر من خطوتين متتاليتين متعددة (RT PCR وتمهيدي) قبل الكمي - RT singleplex. ومع ذلك ، متعددة قبل التضخيم ضروري لتحسين قوة الإشارة ، وخصوصا عندما يقتصر تركيز بدءا من الحمض النووي الريبي. بعيدا عن طريق تنقية قبل PCR المنتجات من الاشعال عن طريق الانتقاء في حجم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلي (الشكل 2) ، فإننا يمكن أن يبرهن على وجود تحسن كبير في الدقة عن طريق الكشف عن مزيد من microRNAs وفقدان اشارات ايجابية كاذبة في كل Dgcr8 -- / -- والمقامر -- / -- خلفيات (أرقام 3a و 3B) بالإضافة إلى تعديل qRT - PCR النهج سمح لتصنيف المناسبة النادرة Dgcr8 الرناوات المستقل / المقامر صغيرة تعتمد على (الشكل 3B) 11. بالتالي خطوة إضافية لتنقية الاشعال المفرط بعيدا عن المنتج قبل PCR هو مفيد بشكل واضح ، خاصة عند استخدام مجموعات كبيرة التمهيدي متعددة لكل عينة.
يتم تحديد العدد الأمثل للدورات السابقة للتضخيم وفقا لتركيزات الحمض النووي الريبي الإدخال. وينبغي أن يسترشد على التوازن الذي لا يخضع لأو overamplify بواسطة تفاصيل تجربة محددة.
مع أكثر من ألف microRNAs المعروفة ، واستخدام معيار 384 لوحات جيدا قد لا تكون الأمثل لالتنميط microRNA واسعة النطاق ، وخصوصا عندما تقارن عينات متعددة. Fluidigm مؤسسة التمويل الدولية في صفيف حيوية تمكن ، مع انخفاض كبير في عدد الخطوات اللازمة pipetting والكيمياء ، واختبار ما يصل الى 96 عينات الفرد من 96 microRNAs مختلفة في تجربة واحدة (9216 ردود فعل) على نطاق واسع نانولتر (6.7 NL). لكل تشغيل البرنامج يوفر تحليل المنحنيات التضخيم ، وخرائط الحرارة مرمزة والقيم عتبة دورة (CT). في وقت واحد على نطاق واسع التنميط يقلل الفروق التجريبية ، ويتيح التعبير يعني التطبيع قيمة ، والذي ينفذ خارج استراتيجيات التطبيع الأخرى التي تجعل من استخدام الضوابط RNA الصغيرة (12).
بالمقارنة مع 384 منصات متوفرة تجاريا جيدا مع تحقيقات TaqMan قبل تعيينه ، فإن الجمع بين منصة عالية الإنتاجية التنميط مع مجموعات التمهيدي مصنوعة خصيصا يوفر مرونة عالية التجريبية.
والأمثل متعددة qRT - PCR النهج في تركيبة مع منصة صفيف الحيوي يسمح بنجاح الشاشة في وقت واحد منا أن 48 مريض السرطان الأمصال البروستاتا لإحداث تغييرات في مستويات من 384 ميرنا (الشكل 4) وتطبيع البيانات دون زيادة كبيرة في التحكم (أي الاصطناعية microRNAs). 11
على الرغم من الزيادة من الخطوات من العينات تمهيدا لنتائج التنميط ، والنهج صفها هو الوقت والتكلفة الفعالة أسلوب إنتاجية عالية إلى ملف مجموعات عينة كبيرة لمستويات التعبير ميرنا ، حتى مع محدودية المواد البداية.
Disclosures
آلان مير هو موظف في شركة Fluidigm. خلاف ذلك ، ليست لدينا مصالح مالية في الكشف عنها.
Acknowledgments
نود أن نشكر مختبر Blelloch عن التعليق على النص. وأيد هذا العمل من جانب صناديق لRB من المعاهد الوطنية للصحة (K08 NS48118 وNS057221 R01) ، معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (المنحة البذور RS1 - 00161 ، ونيو جائزة كلية RN2 - 00906) ، وصندوق بيو الخيرية وزير الخارجية من Wissenschaftlich Urologische غزلشافت فولت.
References
- Mitchell, P. S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).
- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
- Suh, N. MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos. Curr Biol. 20, 271-277 (2010).
- Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).
- Babiarz, J. E. Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells. StemBook. , (2009).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2008).
- Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet. 39, 380-385 (2007).
- Kanellopoulou, C. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19, 489-501 (2005).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat Methods. 1, 47-53 (2004).
- Moltzahn, F. Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients. Cancer Res. 71, 550-560 (2011).
- Mestdagh, P. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).
