Summary
Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.
Abstract
A ampla participação dos miRNAs em processos críticos subjacentes ao desenvolvimento homeostase do tecido, ea doença tem levado a um interesse crescente entre as comunidades científica e farmacêutica. Para estudar miRNAs, é essencial que a quantificação dos níveis de microRNA é precisa e robusta. Através da comparação do tipo selvagem de pequeno RNA deficiente do rato células-tronco embrionárias (MESC), que revelou uma falta de precisão e robustez em anteriores publicadas multiplex qRT-PCR técnicas. Aqui, descrevemos um método otimizado, incluindo purificação longe primers excessiva dos passos anteriores antes de multiplex singleplex detecção em tempo real, o que aumenta dramaticamente a precisão e robustez da técnica. Além disso, explicamos como executar a técnica em um chip microfluídico em volumes nanolitros reduz significativamente os custos de reagentes e tempo permitir eficaz alta taxa de transferência de perfil de expressão de miRNA.
Protocol
1. RNA-Extração: células cultivadas em monocamada
(Seguindo o protocolo do fabricante e utilizando TRIzol.)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # |
| Solução TRIzol | Invitrogen | 15596-018 |
| Álcool isopropílico | Sigma-Aldrich | 1907-1964 |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | C 2432 |
| Etanol | ||
| RNAse água livre |
Homogeneização
- Homogeneizar as células diretamente na placa de cultura pela adição de 1 ml da solução Trizol por 10 cm 2 área prato, redemoinho do Trizol ao redor e pipeta cima e para baixo para garantir a cobertura completa da placa.
Separação de Fase
- Incubar a amostra homogeneizada por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Transferir para um tubo rotulado, adicione 0,2 ml de clorofórmio por 1ml TrizolSolution e agitar vigorosamente à mão tubo por 15 segundos.
- Incubar à temperatura ambiente por 3 minutos.
- Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos a 2 ° C. Após a centrifugação, a mistura se separa em uma fase inferior vermelha, uma interfase e uma fase superior aquosa incolor, que contém o RNA e deve ser de 60% do volume total de solução Trizol.
RNA Precipitação
- Transferir a solução aquosa, contendo RNA fase em um tubo, fresco rotulados.
- Precipitar o RNA, adicionando 0,5 ml de álcool isopropílico por 1 ml de solução Trizol.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Centrifugar a 12.000 xg por 10 minutos a 2 ° C.
RNA-lavagem
- Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante dos tubos.
- Lave o pellet de RNA (na lateral e fundo do tubo), adicionando pelo menos 1 ml de etanol 75% por 1 ml de Trizol Solution, vórtice.
- Centrifugar a 7500 xg por 5 minutos a 2 ° C.
RNA de eluição
- Desprezar o sobrenadante e centrifugar novamente por 1 minuto. Remover o líquido em excesso.
- De ar seco pellet por 5-10 minutos.
Nota: mais de RNA secas é difícil para solubilizar. - Dissolver o sedimento em água livre de RNase pipetando a solução cima e para baixo e incubar por 10 minutos a 55 ° C.
- Medida RNA concentração (A260/280 ratio) usando um espectrofotômetro ™ Nanodrop.
- Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
2. RNA-Extração: Soro
(Protocolo Após Mirvana PARIS fabricante do Kit modificado por Mitchell et al. 1)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # | Comentários |
| mir Vana PARIS Kit Solução de desnaturação 2X Ácido Fenol: Clorofórmio Solução miRNA Wash 1 Solução miRNA Wash 03/02 | Ambion | AM1556 | Modificações no protocolo de |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Etanol | |||
| DEPC água tratada |
Preparação química:
- Adicionar 375 mL de 2-mercaptoetanol para a solução 2X de desnaturação e misture bem.
- Adicionar 21 ml de etanol a 100% para a lavagem Solução miRNA 1.
- Adicionar 40 ml de etanol a 100% para a solução de lavagem miRNA 03/02.
Preparação da amostra:
- Descongelar amostra de soro no gelo.
Homogeneização
- Misturar 300 mL da amostra com um volume igual (300 ml) de solução de desnaturação 2X (devem estar à temperatura ambiente) e vortex.
- Incubar a mistura em gelo durante 5 minutos.
- Adicionar um volume de ácido Fenol: Clorofórmio igual ao volume total da amostra mais o lisado Solução 2X de desnaturação (600 mL).
Importante: NÃO use o tampão aquoso, que se situa no topo do Acid-Fenol: Clorofórmio. - Mistura Vortex por 60 segundos.
- Centrifugar em temperatura ambiente por 15 minutos na velocidade máxima (> xg 10.000). Após a centrifugação, a mistura se separa em uma fase aquosa superior, uma interfase e uma menor fase orgânica.
- Remover aqueous camada em cima (deve ser 300-500 mL incluindo qualquer proteinacious camada de "nebuloso").
- Re-extrair camada aquosa como antes, novamente adicionando clorofórmio.
Importante: A camada aquosa da extração segundo é rotineiramente menor em volume (250 mL). Anotar o volume recuperado.
Preparação de Final RNA-Isolation (RNA total)
- Pré-aquecimento (95 ° C) nuclease sem água.
- Etanol 100% deve estar à temperatura ambiente.
Final de RNA-Isolation (RNA total)
- Adicionar 1,25 volumes de etanol 100% recuperado para a fase aquosa (por exemplo, se 300 ml foi recuperado, adicione 375 mL de etanol) e misture bem.
- Para cada amostra, colocar um cartucho de filtro em um dos tubos de coleta.
- Pipetar o lisado para o filtro.
- Centrifugação (10.000 xg) por 30 segundos, descarte o fluxo-through, centrifugar novamente por 30 segundos e substituir o cartucho de filtro no tubo de coleta mesma.
RNA-Wash
- Aplicar 700 mL de solução de lavagem miRNA 1 para o cartucho de filtro e centrifugar por 15 segundos, descartar o fluxo através do tubo de coleta, e substitua o cartucho de filtro no tubo de coleta mesma.
- Aplicar 500 mL de solução de lavagem miRNA 03/02, centrifugar por 15 segundos, descartar o fluxo através de e repita com um mL 500 segundo de solução de lavagem 03/02.
- Descartar o fluxo através de e seca-spin por 1-2 minutos.
- Cartucho de filtro lugar em um tubo de coleta de fresco, aplicar 100 ml de água livre de RNAse (95 ° C), cap perto e incubar por 2 minutos.
- Centrífuga para a 2 minutos para recuperar o RNA.
- Armazenar a -80 ° C até o uso.
3. Concentração de RNA-Solution (5X)
(Seguindo o protocolo do fabricante)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # |
| Microcontrolador Centrífuga Dispositivos Filter, Ultracell YM-3 | Millipore | 42404 |
| DEPC água tratada |
Dispositivo: microcontrolador Ultracell YM-3, Cutoff SS e DS Nucleotídeos: 10
Volume: volume desejado de re-solução concentrada RNA depende do desenho experimental e deve incluir experimentos de controle.
- Inserir reservatório de amostra microcontrolador no frasco e solução pipeta no reservatório.
Nota: Não toque na membrana. - Centrifugar durante 185 minutos a 4 ° C, com máxima 14.000 x g.
Nota: Posição frasco com a banda de crack para o rotor. - Pipetar volume desejado de água livre de RNAse (por exemplo, 20 l) para o reservatório, reservatório lugar invertido em um novo frasco e girar por 3 minutos a 4 ° C, com máxima 3000 x g.
- Armazenar a -80 ° C até o uso.
4. Transcrição Reversa
(Na sequência de um protocolo por Tang et al. 2 com modificações.)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # | Comentários |
| Alta capacidade kit arquivo cDNA Tampão de cDNA 10x arquivamento dNTP (100 mM) Moloney vírus da leucemia murina (MMLV) transcriptase reversa (50 U / mL) | Applied Biosystems | 4368814 | modificações no protocolo de |
| RNaseOUT (40 U mL /) | Invitrogen | 10777019 | |
| x-plex reverter a mistura de iniciadores haste-laço (40 nM) * | Integrada DNA Technologies | Personalizado | Seqüências * |
| DEPC água tratada |
Volume de reação: 5,5 mL
Nota: a concentração final dos primers haste-laço deve ser 1-5 nM (aqui 2 nM).
Prepare-Master Mix (Volumes por reação) como segue:
| 1. DEPC-Água | 1,959 mL |
| 2. 10x RT-Buffer | 0,55 mL |
| 3. Inibidor de RNase (40 U mL /) | 0,0715 mL |
| 4. dNTP (100 mM) | 0,275 mL |
| 5. x-plex reverter a mistura de iniciadores haste-laço (40 nM) * | 0,275 mL |
| 6. MMLV-RT (50 U mL /) | 0,369 mL |
- Mix e brevemente centrífuga.
- Adicionar 3,5 mL Master Mix-a 2 mL da amostra.
- Execute o seguinte RT-reação:
16 ° C por 30 minutos, seguido de 60 ciclos a 20 ° C por 30 segundos, 42 ° C por 30 segundos, 50 ° C durante 1 segundo e finalmente 85 ° C por 5 minutos para inativar MMLV-RT, 4 ° C ∞ . - Armazenar a -20 ° C até o uso.
* Lista de reverter haste-laço primers podem ser encontradas em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5. Pré-amplificação (Pré-PCR)
(Na sequência de um protocolo por Tang et al. 2 com modificações.)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # | Comentários |
| dNTP (100 mM) | Applied Biosystems | 4368814 | Tampa alta. Kit arquivo cDNA. |
| 2x Universal PCR Master Mix com NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| x-plex mix de primer para a frente (450 nM) * | Integrada DNA Technologies | Personalizado | Seqüências * |
| Primer Universal Reversa (100 mM) | Integrada DNA Technologies | Personalizado | Sequência 2 |
| AmpliTaqGold polimerase (5 U / mL) | Applied Biosystems | 4311806 | |
| MgCl 2 (100 mM) | |||
| DEPC água tratada |
Volume reação: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-Produto)
Nota: pré-amplificação é necessária para aumentar a força do sinal, especialmente quando a concentração inicial de RNA é limitado. A entrada de nível de RNA determina o número ideal de pré-PCR ciclos. Dada a mesma eficiência relativa de cada ciclo de PCR deve dobrar a concentração do produto final. Uma vez que alguns miRNAs será mais alta expressão, evitar o excesso de ciclismo. No entanto, em amplificação pode resultar em uma perda de sensibilidade de detecção, especialmente para microRNAs expresso em níveis baixos. Em nossas mãos 12 ciclos de amplificação pré, usando 100ng de RNA total, apareceu suficiente. Utilizando soro como matéria-prima, 12 ciclos de resultados nos níveis de miRNA detectável, mas 15 ciclos parecia ser superior. Finalmente, começando com três oócitos (cerca de 400 pg de RNA total por oócito 3), 16 ciclos de pré-amplificação com sucesso nos permitiu tela para níveis de expressão de microRNA 4.
* Lista de primers para a frente pode ser encontrada em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
Prepare-Master Mix (Volumes por reação) como segue:
| 1. 2x Universal MM | 13,75 mL |
| 2. DEPC-Água | 0,792 mL |
| 3. MgCl 2 (100 mM) | 0,55 mL |
| 4. dNTP (100 mM) | 1,1 mL |
| 5. x-plex mix de primer para a frente (450 nM) | 3,06 mL |
| 6. Universal RP (100 mM) | 1,375 mL |
| 7. AmpliTaqGold polimerase (5 U / mL) | 1,375 mL |
- Misturar e centrifugar brevemente.
- Adicionar 22 mL Master Mix-a cada 5,5 mL RT-Produto.
- Realizar a reação de pré-PCR seguinte:
95 ° C por 10 min, 55 ° C por 2 min, seguido por 10-18 ciclos de 95 ° C por 1 s e 65 ° C por 1 min, 4 ° C ∞.
6. Purificação do produto pré-PCR
Purificação pela seleção de tamanho em um gel de poliacrilamida 10% nativa
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # |
| 40% de acrilamida / Solução Bis | Bio-Rad | 161-0144 |
| Temed | Bio-Rad | 161-0801 |
| 10 escada de DNA bp | Invitrogen | 10821-015 |
| SYBR Ouro gel de ácido nucléico mancha 10.000 X concentrar em DMSO | Invitrogen | S11494 |
| Glicogênio (20 mg / ml) | Roche | 10 901 393 001 |
| Tampão-EB | ||
| Ammoniumpersulfate 10% (APS) | ||
| TEN-Buffer | ||
| 6x Laranja G | ||
| DEPC água tratada | ||
| ddH2O |
a. Preparação de gel
Para fazer 10ml de uma mistura de poliacrilamida a 10% add
| 1. 2 O DDH | 6,5 ml |
| 2. TBE 10x | 1 ml |
| 3. Poliacrilamida (40%) | 2,5 ml |
| 4. APS (10%) | 80 mL |
| 5. Temed | 4 mL |
- Prepare escada de DNA:
- 0,5 mL 10 bp DNA ladder
- 4,5 mL de buffer (EB)
- 1 ml 6x Laranja G
- Adicionar 5,5 mL 6x G Laranja a cada 27,5 produto Pré-PCR mL.
b. Executar Gel
- Executar Gel com 150V para 55-60 minutos.
Nota: Azul de bromofenol como indicador funciona com região 20bp.
c. Gel Stain
- Mancha gel com SYBR-Gold por 25 minutos em shaker.
Nota: SYBR Gold-se sensível à luz.
d. Corte Gel
- Cortar Pré-PCR banda produto 60-80 bp e transferir para tubo rotulado.
Nota: A banda de baixa entrada RNA pré-PCR produtos podem não ser visíveis. - Esmagar banda gel (por exemplo, em tubo de centrifugação tubo).
e. Re-Extrato de cDNA
- Adicione 300 ml TEN-Buffer e incubar a 37 ° C por 4 horas em um rotador.
- Transferência de fluido para um tubo de recolha rotulado, adicione 300 mL outra TEN-Buffer para o tubo de gel contendo todos os e incubar a 4 ° C durante a noite em um rotador.
- Aspirar o líquido remanescente, transferir para o tubo de coleta rotulados como antes e anotar o volume total recuperado.
f. Precipitação de etanol
- Adicionar 3 volumes de etanol à temperatura ambiente 100%.
- Adicionar 0,5 mL de glicogênio (20 mg / ml).
- Vortex.
- Incubar em gelo seco por pelo menos 2 horas ou a -80 ° C durante a noite.
- Girar em microcentrífuga a 4 ° C durante 30 minutos para pellet cDNA.
- Despejo líquido, adicione 700 mL de etanol a temperatura ambiente de 75% e giro por 10 minutos.
- Despejo fluido e girar novamente por 5 minutos.
- Sugar off sobrenadante sem perturbar pellet e ar seco por 10 minutos.
- Dissolver o sedimento em água limpa.
Nota: o volume desejado da solução concentrada é cDNA dependendo do desenho experimental e deve incluir experimentos de controle.
7. Purificação do produto pré-PCR
Purificação por digestão enzimática de primers seguido pela coluna spin (seguir os protocolos de fabrica)
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # |
| ExoSAP-IT | USB-Affymetrix | 78250 |
| MinElute Kit de Purificação PCR | Qiagen | 28004 |
Nota: Em nossas mãos o exclusivo enzimático de limpeza primers removido com sucesso, mas também levou a degradação parcial do produto pré-amplificados, possivelmente devido à desnaturação parcial dos produtos de curto como a temperatura sobe até 80 ° C durante a etapa de inativação do enzima. Evitando a inativação de calor e directamente purificação dos produtos de PCR da reação enzimática usando colunas de spin remove qualquer produto sem degradação do produto.
- Misturar 5 produto pós-PCR mL com 2 mL ExoSAP-IT.
- Incubar a 37 ° C por 15 minutos para se degradar primers restantes e nucleotídeos.
- Adicionar 5 volumes de tampão PB para 1 volume da reação de PCR e misture, se eu indicador de pH foi adicionado ao tampão PB, verifique se a cor da mistura é amarelo.
- Colocar uma coluna MinElute em um tubo coletor de 2 ml em um rack adequado.
- Aplicar a amostra para a coluna MinElute e centrifugar por 1 minuto.
- Descarte de fluxo, coloque a coluna MinElute de volta para o mesmo tubo e adicionar 750 mL de tampão PE para a coluna MinElute para lavar e centrifugar por 1 minuto.
- Descarte de fluxo e colocar a coluna volta MinElute no mesmo tubo. Centrifugar a coluna para um 1 minuto adicional na velocidade máxima.
- Coloque a coluna MinElute em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Para eluir o DNA, adicionar 10 mL de água DEPC tratada para o centro da membrana, deixar a coluna por 1 minuto, e depois centrifuge por 1 minuto.
8. Fludigim 96,96 Profiling qRT-PCR
| Nome do reagente | Companhia | Prod / Cat # | Comentários |
| Fluidigm 96,96 Kit matriz dinâmica 96,96 matriz dinâmica 96,96 fluido da linha de controle 20x Reagente Loading | Fluidigm Corporação | ||
| Mistura de Primer Universal Reversa (1 mM) Primer para a frente (1 mM) TaqMan Probe (0,2 mM) | Integrada DNA Technologies | Personalizado | Seqüência (1) |
| 2x Universal PCR Master Mix com NoAmpErase UNG | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Tween |
1. Aprontar a 96,96 IFC matriz dinâmica
- Injetar fluido controle de linha (150 mL) em cada um dos acumuladores no chip.
- Chip de lugar para o controlador de IFC (integrado fluídico circuito) e execute o Primeiro-script (136x) para fluido principal controle de linha para o chip.
Nota: Chip precisa ser usado 24 horas após a abertura do pacote. Certifique-se de não derramar o líquido da linha de controle de fluido desde controle de linha no chip ou no entradas faz o chip inutilizado. Chip precisa ser carregado dentro de 60 minutos de priming.
2. Preparação das amostras
2.1 Preparação Pré-Amostra
Em um tubo de plástico descartáveis, combinar os componentes na tabela abaixo para fazer o Sample Pré-Mix (Volumes por entrada).
| 2x TaqMan Universal Master Mix | 2,5 mL |
| 20x Reagente Loading | 0,25 mL |
Nota: O volume final é de 2,75 mL, como excesso de pipeta dispensar perdas
2,2 Preparação de amostras-
Combine em 96 formato bem cada amostra com amostra pré-mix (Volumes por entrada).
| Pré-Mix-Amostra | 2,75 mL |
| Amostra | 2,25 mL |
Nota: Vortex e placa de centrífuga de 96 poços rapidamente para recolher o líquido.
Volume final por 5 mL de entrada, leve em conta a perda de pipetagem, preparando o volume um pouco maior.
2,3 Preparando o Ensaios 13x
- Use uma placa de 96 poços para preparar ensaios 13x. 1x concentrações na tabela abaixo, escala-se para 13x.
| Primer Universal Reversa | 1 mícron (1x) | Seqüência em duas |
| * Primer para a frente | 1 mícron (1x) | * |
| Gene específico TaqMan Probe # | 0,2 m | # |
* Lista de primers para a frente pode ser encontrada em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
# Lista de Sondas TaqMan podem ser encontradas em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- Combine em uma nova placa de 96 alíquotas bem dos ensaios 13x com Tween para uma concentração final de Tween 0,25%
Nota: Volume final por entrada é de 5 mL, prepare um volume suficiente (5,5 mL) para tirar a perda durante a transferência de volume em conta. - Misture bem, evitando bolhas e centrifugar rapidamente para recolher o líquido.
3. Carregando o chip
Nota: A fim de permitir a colocação correta de amostras e ensaios de garantir o posicionamento correto do chip. É conveniente alinhar o entalhe para o canto superior esquerdo.
Garantir que todos os ensaios e soluções de amostra são misturados antes de carregar o chip. É conveniente fazer isso em uma placa de 96 poços e girar o prato para baixo antes de carregar o chip. Estar ciente do mapa chip de pipetagem para referência posterior.
Entradas amostra não utilizada deve ser preenchido com 2,75 mL de amostra Mix e 2,25 mL de água DNA livre.
Entradas de ensaio não utilizados devem ser preenchidos com 2,5 mL de reagente de ensaio de carga e 2,5 mL de água.
Não passar a primeira parada enquanto pipetagem para evitar a introdução de bolhas de ar.
- Depois de carregar as amostras e ensaios (Volume por entrada: 5 mL) executar o Load Mix roteiro script (136x) para carregar as amostras e ensaios para o chip.
- Depois que o script terminar, retire o chip do controlador ICF.
- Descasque o filme protetor azul da parte inferior do chip carregado.
- Remove as partículas de poeira ou detritos da superfície do chip.
4. 96,96 qRT-PCR
- Transferir o chip para o sistema BioMark e usar as seguintes condições de amplificação:
55 ° C por 2 min, 95 ° C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 55 ° C por 1 min. - Seguir o protocolo de fabricação para a coleta de dados software.
5. Usando o software de análise de qPCR
Depois de RT-PCR o software proprietário fornece curvas de amplificação, mapas de calor e valores Ct para cada poço. Por favor, consulte o manual do software para análise de dados.
9. Resultados representativos:
Figura 1. Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. Mostrado é uma descrição passo-a-passo do multiplex qRT-PCR protocolo, incluindo a purificação (E Step) de iniciadores excesso de transcrição reversa multiplex (Etapa C) e pré-amplificação multiplex (Passo D) antes detecção em tempo real (Passo F), resultando em um modelo de cDNA purificado por qRT-PCR. FP: primer microRNA específico para a frente, URP: primer reverso universal, R-SLP: microRNA específico reverso primário haste-laço.
Clique aqui para ampliar a imagem.
Figura 2. . Purificação gel Polyacryamide do modelo qRT-PCR após Bandas pré-PCR de pré-PCR tamanho do produto são exclusivamente visto em amostras WT, mas não em DGCR8 microRNA deficiente - / - ou Dicer - / - amostras (setas) após 96-plex RT e 12 ciclos de pré-amplificação. Note-se que produtos não específicos de origem desconhecida (setas) e primers excessiva são encontrados em todas as amostras (estrelas).
Figura 3. Purificação após pré-amplificação multiplex muito melhora a precisão dos resultados qRT-PCR a) Comparação dos níveis de expressão relativa de WT MESC para Dgcr8 -. / - (MicroRNA canônica deficiente) revela MESC 1) a detecção de microRNAs mais e 2) a perda de falso positivo sinais em Dgcr8 - / - fundos após purificação longe primers do produto pré-PCR. b) Após purificação, os níveis de expressão relativa de ambos os DGCR8 - / - / WT e Dicer - / - / WT mostram uma perda de falso-positivos e permitem a categorização adequada dos raros Dgcr8 independente / Dicer dependentes de pequenos RNAs (miR-320, - 484, -877) 5.
Figura 4. Fluidigm high-throughput perfil miRNA qRT-PCR. Exemplo screen shot de 96,96 Fluidigm perfil mircoRNA qRT-PCR para a tela de alteração nos níveis de miRNA de próstata soros de pacientes com câncer. O software em tempo real análise qPCR fornece curvas de amplificação, mapas com códigos de cores e calor limiar ciclo (Ct).
Discussion
miRNAs são curtos (18-24 nucleotídeos), miRNA RNAs não-codificante, que regulam a expressão do gene pós-transcricionalmente por ambos os RNAs mensageiros de desestabilização (mRNA) e tradução inibindo a sua 6. O fato de que, pelo menos, um terço dos genes humanos contêm conservada vinculativo-sites em seus 3'UTR e as interações evidente de miRNAs com genes para a proliferação, apoptose pluripotência e sugere uma contribuição crítica nas decisões célula destino, a homeostase do tecido e doenças como o câncer 6,7. perfis de expressão Portanto precisa microRNA são de ampla interesse.
Para testar o multiplex publicado qRT-PCR miRNA protocolo de dois perfis de expressão que usamos MESC RNA pequeno deficiente como controles negativos. DGCR8 - / - as células são deficientes de todos os microRNAs canônica, enquanto Dicer - / -. Células falta micoRNAs tanto canônicos e não-canoncial 8,9
Comparar os níveis no tipo selvagem MES-to DGCR8 - / - células, nós descobrimos uma falta de precisão como vários expressa microRNAs 10 não foram detectados nas células do tipo selvagem 11. Alguns até mostraram níveis mais baixos de expressão em relação às células knockout (Figura 3a). Trabalhamos com a hipótese de que a falta de precisão pode ser causado pela cartilha maciça reporte de duas etapas consecutivas multiplex (RT e Pré-PCR) antes singleplex RT quantificação. No entanto, multiplex de amplificação pré-é necessário para aumentar a força do sinal, especialmente quando a concentração inicial de RNA é limitado. Purificando distância pré-PCR produtos de primers por seleção de tamanho em géis de poliacrilamida nativo (Figura 2), conseguimos demonstrar uma melhoria substancial na precisão através da detecção de microRNAs mais e uma perda de falso-positivos em ambos os Dgcr8 - / - e Dicer - / - fundos (Figuras 3a e 3b) Além disso, a abordagem modificada qRT-PCR permitiu a própria categorização de rara Dgcr8 independente / Dicer dependentes de pequenos RNAs (Figura 3b) 11. Portanto, um passo adicional para purificar primers excessiva longe de pré-PCR produto é claramente vantajosa, especialmente quando se utiliza primers multiplex grandes conjuntos por amostra.
O número ideal de ciclos de pré-amplificação é determinado pelas concentrações de entrada de RNA. O equilíbrio para não sub ou overamplify deve ser orientada por indicações do experimento específico.
Com mais de um milhar de microRNAs conhecida, o uso de padrão de 384 poços placas pode não ser ideal para o perfil de microRNA extensa, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A IFC Matriz Fluidigm dinâmico permite, com uma diminuição significativa das etapas de pipetagem e química necessário, testes de até 96 amostras individuais contra 96 microRNAs diferentes em um único experimento (9216 reações) em nanolitros escala (6,7 nL). Para cada execução do software de análise fornece curvas de amplificação, mapas com códigos de cores e valores de calor de ciclo threshold (Ct). O perfil de grande escala simultânea reduz as variações experimentais e permite a normalização significa expressão de valor, que fora executa estratégias de normalização outros que fazem uso de controles de pequeno RNA. 12
Em comparação com 384 plataformas disponíveis comercialmente bem com sondas TaqMan pré-atribuído, a combinação de uma plataforma de perfil alto rendimento com conjuntos feitos por cartilha oferece flexibilidade experimental de alta.
O otimizado multiplex abordagem qRT-PCR em combinação com a plataforma de matriz dinâmica com sucesso nos permitiu, simultaneamente, tela de 48 soros de pacientes com câncer de próstata por alterações nos níveis de miRNA 384 (Figura 4) e para normalizar os dados, sem aumento nos controles (ie sintéticos microRNAs). 11
Apesar do aumento de passos desde a preparação de amostras para resultados de perfil, a abordagem descrita é um tempo e custo-eficaz método de alto rendimento para o perfil grandes conjuntos de amostras de níveis de expressão de miRNA, mesmo com material de partida limitada.
Disclosures
Alan Mir é um funcionário da Corporação Fluidigm. Caso contrário, não temos interesses financeiros de divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao laboratório Blelloch para comentar sobre o texto. Este trabalho foi financiado por fundos para RB de NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, Faculdade Prêmio New RN2-00906) ea Fundação Pew Charitable e FM a partir do Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.
References
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- Tang, F. 220-plex microRNA expression profile of a single cell. Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).
- Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).
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