Immunocitochimica: cellule staminali neuronali

Summary

Immunocitochimica è un potente metodo per determinare la presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passaggi che permettono di conservare gli anticorpi e ottenere il massimo della propria colorazione.

Abstract

Immunocitochimica è un metodo molto potente e molto semplice per la determinazione della presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse, più comunemente una proteina, in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passi che permetterà ai ricercatori di conservare gli anticorpi primari e secondari mentre ottenere alta qualità, qualità riproducibile e dati quantitativi dalla loro colorazione. Ci sono due aspetti di questo protocollo che consente di preservare il volume di anticorpi necessari per la colorazione. Per uno, le cellule sono coltivate su piccole lamelle circolari che sono posti in pozzetti di una piastra di coltura dei tessuti. Dopo la fissazione, le cellule su vetrini possono essere rimossi dai pozzetti della piastra. Per la colorazione degli anticorpi, il vetrino con le cellule è invertita su una piccola goccia di soluzione di anticorpi su parafilm ed è coperto con un secondo pezzo di parafilm per evitare l'essiccazione. Utilizzando questo metodo, solo ~ 25 ml di soluzione di anticorpi è necessario per ogni coprioggetto (o campione) per essere colorato. Questo protocollo descrive immunocolorazione di staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs), ma può essere usato per molti altri tipi di cellule.

Protocol

Giorno 1: Preparazione di cellule coprioggetto di vetro tedesco e Semina

Nota: coprioggetto di vetro tedesco sono spesso preferibili per la coltura delle cellule staminali neurali primarie e neuroni. Usiamo il seguente protocollo di pulizia per migliorare l'adesione cellulare e la diffusione. Coprioggetto posizione in un rack di piccole dimensioni che consentirà l'accesso liquido entrambi i lati del vetrino. In primo luogo, coprioggetto incubare 1% Liquinox per 10 minuti, seguita da 3 lavaggi con acqua deionizzata. Assicurarsi che non rimangano bolle di sapone. Poi, scivola incubare in HCl 1M per 30 minuti, seguita da 3 lavaggi con acqua deionizzata. Coprioggetto secco a 65 ° C durante la notte. Trasferimento coprioggetto per un piatto di vetro e autoclave per la sterilizzazione.

1. In una cappa colture di tessuti, luogo coprioggetto sterili in una piastra di dimensioni adeguate bene.
   
   
2. Coprioggetto cappotto con laminina per l'adesione cellulare. Coprioggetto incubare a 10 mcg / ml poli D-lisina (PDL) in acqua sterile per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere coprioggetto PDL e incubare a 20 mg / ml in laminina Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore.
   
   
   
   1. Nota: Fare riferimento all'articolo Passaging neurali Cellule staminali umane ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) e il conteggio umani articolo Neural Stem Cells ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) per imparare a risospendere e contare hNSPCs.
      
      
3. Sciacquare laminina rivestita vetrini con PBS e cellule seme in ogni coprioggetto contenenti oltre a una certa densità (spesso usiamo una densità iniziale di placcatura 100,000-300,000 cellule / ml per le cellule che stiamo placcatura per immunostaining).
   
   
4. Piastra in 37 ° C di coltura tissutale incubatore e consentono alle cellule di aderire al coprioggetti (di solito un minimo di 4 ore è richiesto).

Giorno 2: Fissaggio, Permeabilizing, blocco, e aggiunta di anticorpo primario alle celle

Nota: utilizzare il fissativo seguente paraformaldeide 4% per preservare la morfologia cellulare. La ricetta prevede una transizione di pH per consentire al paraformaldeide di andare in soluzione. Noi preferiamo questo metodo piuttosto che l'utilizzo del calore per sciogliere paraformaldeide perché temperature più elevate possono portare alla generazione di acido formico, che può aumentare la colorazione di fondo quando si usa fluorescenza. Alcuni componenti del fissativo aiutare a preservare la struttura del citoscheletro (MgCl ₂ e EGTA), mentre altri aiutano a mantenere la morfologia complessiva (saccarosio).

Fissativo paraformaldeide 4% per le celle

Reagenti e procedura:	Importo per 100 ml di fissativo:
MilliQ acqua	75 ml
Paraformaldeide (pesare nella cappa)	4 g
10N NaOH, mescolare e aggiungere goccia a goccia fino a quando la soluzione cancella	secondo necessità
10X PBS	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Saccarosio	4 g
HCl 6N, titolare a pH 7,4	secondo necessità
MilliQ acqua	portare a 100 ml
Conservare a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. Calda a 37 ° C prima dell'uso

1. In panchina, rimuovere il supporto e aggiungere fissativo preriscaldata. Incubare per 5-15 minuti (a seconda della antigene per essere rilevato, usiamo di solito 10 minuti). Eseguire questa e le seguenti operazioni a temperatura ambiente.
   
   
2. Scartare il fissativo in un apposito contenitore, come molte istituzioni paraformaldeide gestire come rifiuti pericolosi. Lavare le cellule 3 volte con PBS, a 5 minuti ogni volta. Quando si rimuove soluzioni da parte delle cellule, fare attenzione che di aspirazione non si asciuga le cellule. Inoltre, sempre la prossima soluzione a portata di mano per aggiungere alle cellule prima di rimuovere la soluzione in modo che ricopre le cellule non sono lasciati ad asciugare.
   
   
3. Se l'antigene di interesse all'interno della cellula, la membrana cellulare deve essere permeabile per consentire l'ingresso degli anticorpi. Per permeabilize celle, utilizzare un nuovo 0,3% Triton X-100 soluzione in PBS. Pipetta lentamente perché Triton è viscoso, e assicurarsi che il detergente è completamente dissolto in PBS prima di aggiungere alle cellule. Permeabilize cellule per 5 minuti, seguito dal lavaggio delle cellule 3 volte con PBS, a 5 minuti ogni volta.
   
   
4. Le cellule devono essere trattati con un agente di blocco per impedire legame non specifico degli anticorpi. Noi usiamo sieroalbumina bovina (BSA) come agente di blocco. La soluzione bloccante è preparata sciogliendo 5% BSA in PBS (su un bilanciere o dei rotatori, perché ci vuole tempo per sciogliere), quindi filtrare il soldistribuzione pesi con un filtro a siringa da 0,45 micron. Bloccare le cellule nel 5% BSA / PBS soluzione per 1 ora a temperatura ambiente.

Diluire l'anticorpo primario (che si spera sia specifico per la proteina di interesse) per un pre-determinato la concentrazione di 1% BSA / PBS (preparate per diluizione dal 5% BSA / PBS). Luogo diluito anticorpo primario (30 microlitri per 25 coprioggetto mm, 20 l 18 per coprioggetto mm, 15 microlitri per 12 coprioggetto mm) su una lastra di vetro coperto con parafilm. Sollevare il vetrino con le cellule fisse, invertire tale che le cellule a faccia in giù, e adagiarla sulla soluzione di anticorpi in modo che le cellule sono in contatto con l'anticorpo. Inserire una seconda striscia parafilm oltre il costrutto intero. Incubare a 4 ° C durante la notte.

3 ° giorno: lavaggio, Incubazione anticorpo secondario, Mordente nucleare e di montaggio

1. Rimuovere con attenzione la striscia in alto parafilm e raccogliete il coprioggetti, negarli, e rimetterla nella piastra con PBS in ciascun pozzetto di lavaggio in modo che le cellule sono rivolti verso l'alto.
   
   
2. Lavare le cellule 3 volte con PBS, a 5 minuti ogni volta.
   
   
3. Scegli un anticorpo secondario che rileverà l'anticorpo primario, per esempio, se l'anticorpo primario è stato fatto in un coniglio, l'anticorpo secondario dovrebbe riconoscere IgG di coniglio. Fare attenzione a corrispondere anche gli anticorpi isotipo (IgG, IgM, ecc.) Se si usano più anticorpi primari, assicurarsi che siano di specie diverse o isotipi, e il piano da rilevare con marcatori diversi attribuiti agli anticorpi secondari. Per esempio, è possibile utilizzare un anti-coniglio accoppiato secondaria ad un fluoroforo rosso con un accoppiamento anti-topo secondaria ad un fluoroforo verde. Incubare cellule nella soluzione di anticorpo secondario diluito ad una concentrazione appropriata in BSA 1% per 2 ore al buio a temperatura ambiente, utilizzando la stessa tecnica impiegata per primaria (passaggi non mostrato nel video). Il volume di anticorpo secondario necessari per l'incubazione può essere leggermente superiore a quello per l'anticorpo primario se il secondario è memorizzato come una soluzione di glicerolo (40 microlitri per 25 coprioggetto mm, 30 microlitri per coprioggetto 18 mm, 25 microlitri per 12 coprioggetto mm) .
   
   
   • Nota: Se si utilizza molecole fluorescenti per visualizzare l'anticorpo secondario, il campione deve essere protetta dalla luce, una volta che l'anticorpo secondario è stato aggiunto. Incubare al buio, o in un piatto foglio coperto.
     
     
4. Rimuovere con attenzione i coprioggetti dai parafilm come descritto per l'anticorpo primario. Lavare le cellule 2 volte con PBS, 5 minuti ogni volta, seguita da una incubazione di 1 minuto in 2 mg / ml Hoechst nucleare macchia diluito in PBS (se di contrasto nucleare è preferito). Se la macchia Hoechst è vecchio e il segnale è troppo debole, è possibile aumentare il tempo di incubazione e / o la concentrazione. Dopo l'incubazione con Hoechst, lavare 1 volta con PBS per 5 minuti.
   
   
5. Il coprioggetto deve essere montato su un vetrino con mezzi di montaggio per la visualizzazione su un microscopio. Nei casi in cui viene utilizzato una molecola fluorescente per la visualizzazione dei anticorpo secondario, i mezzi di montaggio dovrebbe contenere agenti per minimizzare photobleaching. Noi usiamo Vectashield come mezzo di montaggio per fluorescenza. Inserire un calo di dimensioni adeguate Vectashield su un vetrino da microscopio (12 microlitri per 25 coprioggetto mm, 6 microlitri per 18 coprioggetto mm, 3 ml per 12 coprioggetto mm).
   
   
6. Cura ritirare il vetrino e lavare la schiena con acqua deionizzata per eliminare i sali (dal PBS). Tamponare l'acqua in eccesso su un tovagliolo di carta o kimwipe, e giaceva sul goccia di Vectashield con le cellule verso il basso. Posizionare il coprioggetto in un angolo e permettono di scendere lentamente per evitare bolle d'aria cattura. Etichettare il vetrino con la data e le informazioni sul campione.
   
   
7. Permettere che i vetrini con coprioggetto per asciugare (al buio) di aspirazione poi via Vectashield eccesso intorno al bordo coprioggetto. I bordi coprioggetto può ora essere sigillato con smalto, se lo si desidera (particolarmente utile se coprioggetto saranno visualizzati su un microscopio invertito). Di solito il nostro negozio di diapositive in un congelatore di -20 ° C.

Discussion

Questo protocollo descrive una procedura per immunocolorazione hNSPCs che riduce al minimo il volume di anticorpi necessari e dà colorazione affidabile cellulare. La procedura descritta è meglio per gli antigeni intracellulari, ma può essere modificato per macchiare le molecole della superficie cellulare o per migliorare la colorazione del citoscheletro.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous