كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Summary

كيمياء سيتولوجية مناعية قوية هو وسيلة لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين أحد الأجسام المضادة للحفاظ على والحصول على أقصى استفادة من تلطيخ واحد.

Abstract

كيمياء سيتولوجية مناعية هو وسيلة قوية للغاية واضحة إلى حد ما لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة ، والأكثر شيوعا وهو بروتين في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين الباحثين للحفاظ على الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في حين الحصول على الجودة العالية والنوعية والبيانات الكمية استنساخه من تلوين الخاصة بهم. هناك جانبان لهذا البروتوكول الذي يساعد على الحفاظ على حجم الأجسام المضادة اللازمة للتلوين. لأحد ، وتزرع الخلايا على coverslips الصغيرة الدائرية التي يتم وضعها في الآبار من نسيج لوحة الثقافة. بعد التثبيت ، يمكن إزالة الخلايا على coverslips من الآبار لوحة. لتلوين الأجسام المضادة ، هو مقلوب ساترة مع الخلايا على قطرة صغيرة من المحلول على الضد parafilm ومغطاة بقطعة الثاني من parafilm لمنع جفاف. باستخدام هذا الأسلوب ، وهناك حاجة فقط ~ 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل ساترة (أو عينة) ليكون الملون. يصف هذا البروتوكول immunostaining من الخلايا الجذعية البشرية / السلائف العصبي (hNSPCs) ، ولكن يمكن استخدامها لكثير من أنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

اليوم 1 : خلايا إعداد Coverslips زجاج الألمانية والبذر

ملاحظة : coverslips الزجاج الألماني غالبا ما تكون الأفضل لزراعة الخلايا الجذعية الأولية العصبي والخلايا العصبية. نحن نستخدم بروتوكول التنظيف التالية لتحسين التصاق الخلايا وانتشارها. coverslips الموقف في رف صغير من شأنها أن تسمح بالوصول السائلة إلى جانبي ساترة. الأولى ، في احتضان coverslips Liquinox 1 ٪ لمدة 10 دقيقة ، تليها 3 يغسل بماء منزوع الأيونات. تأكد من عدم وجود فقاعات الصابون لا تزال قائمة. المقبل ، وقسائم في احتضان حمض الهيدروكلوريك 1M لمدة 30 دقيقة ، تليها 3 يغسل بماء منزوع الأيونات. coverslips الجافة على 65 درجة مئوية خلال الليل. coverslips نقل إلى صحن الزجاج وتعقيم لتعقيم.

1. هود في نسيج الثقافة والمكان في لوحة coverslips العقيمة بئر بحجم مناسب.
   
   
2. coverslips معطف مع laminin للالتصاق الخلية. coverslips احتضان في 10 ميكروغرام / مل بولي D - يسين (PDL) في الماء المعقم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة coverslips PDL واحتضانها في 20 ميكروغرام / مل في laminin EMEM لمدة 4 ساعات ، أو بين عشية وضحاها ، في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة.
   
   
   
   1. ملاحظة : يرجى الرجوع إلى الإنسان الركض الخلايا الجذعية العصبية المادة ( http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=263 ) والإنسان العصبية العد المادة الخلايا الجذعية ( http://www.jove.com / مؤشر / Details.stp؟ ID = 262 ) لمعرفة كيفية resuspend hNSPCs والعد.
      
      
3. شطف laminin المغلفة coverslips مع برنامج تلفزيوني والبذور في كل الخلايا التي تحتوي على ساترة البئر على كثافة معينة (ونحن غالبا ما تستخدم في كثافة الطلاء الأولي 100،000-300،000 خلية / مل لخلايا أننا الطلاء لimmunostaining).
   
   
4. لوحة مكان في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة ويسمح للخلايا التمسك coverslips (عادة ما لا يقل عن 4 ساعات هو مطلوب).

اليوم 2 : إصلاح ، Permeabilizing ، حجب ، وإضافة إلى خلايا جسم الابتدائية

ملاحظة : نحن نستخدم ما يلي تثبيتي بارافورمالدهيد 4 ٪ للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا. وصفة يتضمن الانتقال الرقم الهيدروجيني للسماح للبارافورمالدهيد للذهاب الى حل. نحن نفضل هذه الطريقة بدلا من استخدام الحرارة لإذابة بارافورمالدهيد بسبب ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يؤدي إلى توليد حمض الفورميك ، والتي يمكن أن تزيد تلوين الخلفية عند استخدام مضان. بعض المكونات من العون للحفاظ على هيكل تثبيتي هيكل الخلية ₍₂ و MgCl EGTA) ، بينما تساعد على الحفاظ على التشكل العام (السكروز).

4 ٪ لامتصاص العرق تثبيتي للخلايا

الكواشف والخطوات التالية :	مبلغ 100 مل من تثبيتي :
MilliQ المياه	75 مل
بارافورمالدهيد (تزن في غطاء الدخان)	4 ز
10N هيدروكسيد الصوديوم ، وإثارة وإضافة قطرة قطرة حتى حل يزيل	حسب الحاجة
10X PBS	10 مل
1M MgCl 2	0.5 مل
0.5 M EGTA	2 مل
السكروز	4 ز
6N حمض الهيدروكلوريك ، يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7.4	حسب الحاجة
MilliQ المياه	يرتفع الى 100 مل
المحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام

1. على مقاعد البدلاء ، وإزالة وسائل الاعلام وإضافة تثبيتي prewarmed. لاحتضان 5-15 دقائق (اعتمادا على أن يتم الكشف عن مستضد ، ونحن نستخدم عادة 10 دقيقة). وتنفيذ هذه الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.
   
   
2. تجاهل تثبيتي في وعاء مناسب ، والتعامل مع العديد من المؤسسات بارافورمالدهيد كنفايات خطرة. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة. عند إزالة الحلول من الخلايا ، وتوخي الحذر بأن الشفط لا تجف الخلايا. أيضا ، يكون دائما الحل في متناول اليد المقبل إضافة إلى إزالة الخلايا قبل الحل الذي المعاطف لهم حتى لا تترك لتجف الخلايا.
   
   
3. إذا كان داخل الخلية مستضد المصالح ، يجب أن تكون غشاء الخلية منفذة للسماح بدخول الأجسام المضادة. لpermeabilize الخلايا ، استخدام الطازجة بنسبة 0.3 ٪ تريتون X - 100 الحل في برنامج تلفزيوني. ماصة ببطء لأن تريتون هو لزج ، وتأكد هو تتفكك المنظفات في برنامج تلفزيوني قبل إضافة إلى الخلايا. Permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق ، ثم غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة.
   
   
4. ويجب أن يعامل الخلايا مع وكيل لمنع عرقلة غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة. نستخدم ألبومين المصل البقري (BSA) كعامل حظر. يتم حجب الحل عن طريق إذابة BSA 5 ٪ في برنامج تلفزيوني (على الروك أو المدورة لأنه يستغرق وقتا طويلا في حل) تصفية ثم سولution مع فلتر حقنة 0.45 ميكرون. كتلة الخلايا في حل جيش صرب البوسنة / PBS 5 ٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

تمييع الضد الأساسي (الذي هو المأمول محددة للبروتين من الفائدة) إلى تركيز محدد مسبقا في 1 ٪ BSA / PBS (أعدها التخفيف من 5 ٪ BSA / PBS). مكان المخفف الضد الابتدائي (30 ميكرولتر في ساترة 25 مم ، 20 ميكرولتر في ساترة 18 مم و 15 مم ساترة لكل ميكرولتر 12) على لوحة زجاجية مغطاة parafilm. التقط ساترة مع الخلايا الثابتة ، عكس هذه الخلايا التي وجهها لأسفل ، ووضع ذلك على الضد حل بحيث الخلايا على اتصال مع الأجسام المضادة. وضع الشريط parafilm الثاني على بناء بأكملها. احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.

يوم 3 : الغسل ، الحضانة جسم الثانوية ، وصمة عار النووية والتركيب

1. إزالة الشريط بعناية parafilm العلوي والتقط ساترة ، عكس ذلك ، ووضعه مرة أخرى إلى لوحة مع برنامج تلفزيوني في كل يغسل جيدا لدرجة أن الخلايا هي مواجهة.
   
   
2. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة.
   
   
3. اختيار الأضداد الثانوية التي من شأنها الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ، على سبيل المثال ، إذا كان أدلى الضد الأساسي في الأرانب ، والأجسام المضادة الثانوية يجب أن تعترف الأرنب مفتش الحكومة. الحرص على تطابق أيضا isotype الأضداد (IgG والغلوبولين المناعي ، الخ). إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية متعددة ، تأكد من أنها من الأنواع المختلفة أو isotypes ، والكشف عن خطة لمع علامات مختلفة تعلق على الأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال ، هل يمكن استخدام يقترن المضادة للأرنب ثانوية لfluorophore الحمراء مع جانب ضد الماوس ثانوية لfluorophore الخضراء. احتضان الخلايا في الجسم المضاد الثانوي حل المخفف إلى التركيز المناسب في جيش صرب البوسنة 1 ٪ لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، وذلك باستخدام تقنية لنفس الابتدائية (الخطوات لا يظهر في شريط الفيديو). قد حجم الأجسام المضادة الثانوية اللازمة لحضانة يكون أكبر قليلا من تلك التي للأجسام المضادة الأولية إذا تم تخزين ثانوية كحل الجلسرين (40 ميكرولتر في ساترة 25 مم و 30 مم ساترة ميكرولتر في 18 و 25 ميكرولتر في ساترة 12 ملم) .
   
   
   • ملاحظة : إذا كنت تستخدم جزيئات الفلورسنت لتصور الجسم المضاد الثانوي ، ويجب أن يكون نموذج محمية من الضوء مرة واحدة تم إضافة الجسم المضاد الثانوي. احتضان في الظلام ، أو في لوحة احباط المغطاة.
     
     
4. إزالة بعناية coverslips من parafilm صفه للجسم الأساسي. غسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق في كل مرة ، يليه في الحضانة 1 دقيقة 2 ميكروغرام / مل النووية هويشت صمة مخففة في برنامج تلفزيوني (إذا كان يفضل ملون مباين النووية). إذا كان وصمة عار هويشت قديمة والإشارة قاتمة جدا ، ويمكنك زيادة فترة حضانة و / أو تركيز. بعد حضانة مع هويشت ، ويغسل 1 الوقت مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
   
   
5. وينبغي أن يتم تنظيمها coverslips على شريحة متزايدة مع وسائل الاعلام عن التصور على المجهر. في الحالات التي يتم استخدام جزيء نيون للتصور من الأجسام المضادة الثانوية ، يجب أن تحتوي على وسائل الاعلام المتزايدة للحد من عوامل photobleaching. نحن نستخدم وسائل الاعلام بوصفها Vectashield متزايدة لمضان. مكان هبوط الحجم المناسب للVectashield على شريحة المجهر (12 ميكرولتر في ساترة 25 مم و 6 لكل ميكرولتر ساترة 18 مم و 3 مم ساترة لكل ميكرولتر 12).
   
   
6. اختيار بعناية وساترة وشطف الظهر مع الماء منزوع الأيونات لإزالة الأملاح (من برنامج تلفزيوني). وضع الداب قبالة المياه الزائدة على kimwipe أو منشفة ورقية ، وعلى قطرة Vectashield مع خلايا أسفل. ضع ساترة على بزاوية والسماح لتنحدر ببطء لتجنب فقاعات الهواء محاصرة. تسمية الشريحة مع التاريخ ، وأية معلومات العينة.
   
   
7. تسمح الشرائح مع coverslips حتى يجف (في الظلام) شفط ثم قبالة Vectashield الزائدة من حول حافة ساترة. ويمكن الآن حواف ساترة تكون مختومة مع طلاء الأظافر ، إذا كان المطلوب (مفيدة خصوصا إذا كان سيتم عرضها على coverslips المجهر المقلوب). وعادة ما نقوم بتخزين الشرائح لدينا في الفريزر -20 درجة مئوية.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراء immunostaining hNSPCs لأنه يقلل من حجم الأجسام المضادة الضرورية ويعطي موثوقة تلوين الخلية. الإجراء كما هو موضح هو أفضل لمستضدات الخلايا ، ولكن يمكن تعديلها لطخه جزيئات سطح الخلية أو لتعزيز تلطيخ من الهيكل الخلوي.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous