免疫細胞：ヒト神経幹細胞

Summary

免疫細胞が存在、細胞内局在性、および培養細胞における目的の抗原の相対量を決定する強力な方法です。このプロトコルは1つの抗体を節約し、自分の染色を最大限に活用することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。

Abstract

免疫細胞は、最も一般的に存在を決定するための非常に強力で、かなり簡単な方法、細胞内局在、及び目的の抗原の相対量、培養細胞での蛋白質、である。このプロトコルは、それらの染色質の高い、再現性の定性的および定量的データを取得中に研究者が一次および二次抗体を節約することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。染色のために必要な抗体の量を節約するために役立つ、このプロトコルには2つの側面があります。一つは、細胞は組織培養プレートのウェルに配置されている小型の、円形のカバーグラス上で増殖されています。固定後、カバースリップ上の細胞は、プレートのウェルから除去することができます。抗体染色の場合は、セルとカバースリップをパラフィルム上に抗体溶液の小滴の上に反転し、乾燥を防ぐためパラフィルムの2番目の部分で覆われている。この方法を使用して、抗体溶液のだけ〜25μlの染色される各カバースリップ（またはサンプル）のために必要です。このプロトコルは、ヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の免疫染色について説明します、しかし他の多くの細胞型に使用することができます。

Protocol

1日目：ドイツのガラス製カバースリップとその種の細胞を調製する

注 ：ドイツのガラス製カバースリップは、多くの場合、培養一次神経幹細胞および神経細胞に対して好ましい。我々は、細胞接着と拡散を改善するために以下の洗浄プロトコルを使用してください。カバーの両側に液体のアクセスを許可する小さなラック内の位置は、カバースリップ。最初に、脱イオン水で3回洗浄に続いて10分間1％Liquinoxにカバースリップを、インキュベートする。は石鹸の泡が残っていないことを確認してください。次に、30分間1M HCl中でインキュベートスリップは、脱イオン水で3回洗浄した。 65℃乾燥したカバースリップ℃で一晩。ガラス皿と滅菌するオートクレーブにカバースリップを転送します。

1. 組織培養フードの中で、適切なサイズのウェルプレートに滅菌カバーグラスを置く。
   
   
2. 細胞接着のためのラミニンでコートカバースリップ。室温で5分間10μg/ mlのポリ滅菌水でD -リシン（PDL）でカバースリップをインキュベートする。 37℃の組織培養インキュベーターで、一晩4時間、またはのためのEMEM 20μg/ mlのラミニンでPDLとインキュベートカバースリップを取り除きます。
   
   
   
   1. 注 ： 継代ヒト神経幹細胞の記事（への参照http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）とカウントヒト神経幹細胞の記事（ http://www.jove.com /インデックス/ Details.stp？ID = 262 hNSPCsを再懸濁し、カウントする方法を学ぶ）。
      
      
3. 各カバースリップを含む一定の密度でも（私たちはしばしば、我々は免疫染色のためにメッキされたセルのための100,000-300,000細胞/ mlの初期播種密度を使用）にPBSとシード細胞とラミニンでコーティングされたカバースリップをすすぐ。
   
   
4. 場所は37のプレート℃の組織培養インキュベーターおよび細胞はカバースリップ（通常4時間の最小値が必要とされる）に付着することができます。

2日目：固定、透過性、ブロッキング、および細胞に一次抗体を追加する

注 ：我々は、細胞の形態を維持するために、以下の4％パラホルムアルデヒド固定液を使用する。レシピは、パラホルムアルデヒドが溶液に入るようにするpHの移行が含まれています。より高い温度で蛍光を使用するときにバックグラウンド染色を増加させることができますギ酸の生成につながる可能性があるので、この方法ではなく、パラホルムアルデヒドを溶解するために熱の使用を好む。他の全体的な形態（ショ糖）を維持するのに役立つしながら固定ヘルプの一部のコンポーネントは、細胞骨格構造（MgCl ₂及びEGTAを）維持する。

細胞を4％パラホルムアルデヒド固定液

試薬と手順：	固定液の100mLのための金額：
MilliQ水	75ミリリットル
パラホルムアルデヒド（ドラフト内で秤量）	4グラム
10N NaOHは、かき混ぜると解決策が解消されるまで滴下して加える	必要に応じて
10 × PBS	10ミリリットル
1M MgCl 2の	0.5ミリリットル
0.5 M EGTA	2ミリリットル
スクロース	4グラム
6N塩酸、pH7.4に滴定する	必要に応じて
MilliQ水	100mlに持参
最大1週間まで4℃で保存する。 37℃くらいまで温め、使用前に

1. ベンチで、メディアを取り出して、温めておいた固定液を加える。 5-15分（検出する抗原に応じて、我々は通常10分を使用）インキュベートする。この、室温では、次の手順を実行します。
   
   
2. 多くの機関が有害廃棄物としてホルムアルデヒドを取り扱うよう、適切なコンテナに固定液を捨てる。 PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄。細胞からソリューションを削除する際に、吸引は細胞を乾燥させないこと。また、いつものコートが、それらは非常に細胞が乾燥して残っていないしているソリューションを削除する前にセルを追加する一方で、次のソリューションを持っている。
   
   
3. 目的の抗原が細胞内にある場合、細胞膜は、抗体のエントリを可能にするために透過性にする必要があります。細胞を透過性に、PBSで新鮮な0.3パーセントトリトンX - 100溶液を使用してください。ピペットは、徐々にトリトンは粘性であり、そして洗剤が完全に細胞に添加する前に、PBSに溶解されていることを確認しますので。 PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄した細胞を5分、透過処理。
   
   
4. 細胞は、抗体の非特異的結合を防ぐためにブロッキング剤で処理する必要があります。我々は、ブロッキング剤としてウシ血清アルブミン（BSA）を使用してください。 （それは溶解に時間がかかるので、ロッカーやローテーター上で）ブロッキング溶液をPBSに5％BSAを溶解して作られてからゾルをフィルタリング0.45μmのシリンジフィルターでution。室温で1時間5％BSA / PBS溶液に細胞をブロックする。

1％BSA / PBS（5％BSA / PBSから希釈して調製）で事前に決められた濃度に（興味の蛋白質のためうまくいけば、特定のである）一次抗体を希釈します。場所は、パラフィルムで覆われたガラス板上に一次抗体（25mmのカバースリップあたり30μL、18 mmのカバースリップあたり20μlの、12mmのカバースリップあたり15μl）を希釈した。細胞は下向きに、そして細胞が抗体と接触しているように抗体溶液の上に置くように反転させる、固定された細胞をカバースリップを拾う。構造全体での秒パラフィルムストリップを配置。 4℃で一晩インキュベートする。

3日目：洗濯、二次抗体のインキュベーション、核染色および取付け

1. 慎重に細胞が上直面しているので、トップパラフィルムストリップを取り外して、カバースリップをピックアップ、それを反転し、洗浄のために各ウェルにPBSでプレートに戻して置きます。
   
   
2. PBS、5分ごとに時間で細胞を3回洗浄。
   
   
3. 一次抗体がウサギで行われた場合には、一次抗体を検出する二次抗体を選択して、例えば、、二次抗体はウサギIgGを認識すべきである。また、抗体（IgG、IgM抗体、等）抗体のアイソタイプが一致するように注意してください。複数の一次抗体を使用している場合、それらが異なる種またはアイソタイプ、および二次抗体に接続された別のマーカーを検出するために計画からのものであることを確認してください。たとえば、緑色の蛍光体に結合した抗マウス二次で赤蛍光体に抗ウサギ二次結合を使用することができます。一次と同じ技法を用いて、室温で暗所で2時間、1％BSAで適当な濃度に希釈した二次抗体溶液で細胞をインキュベート（ビデオには示されていないステップ）。二次はグリセリン溶液（25 mmのカバースリップあたり40μlの、18mmのカバースリップあたり30μL、12 mmのカバースリップあたり25μlの）として格納されている場合、インキュベーションに必要な二次抗体の量は、一次抗体のそれよりわずかに大きくなることがあります。
   
   
   • 注 ：あなたが二次抗体を可視化する蛍光分子を使用している場合は、試料が二次抗体が追加された後、光から保護される必要がある。暗闇の中で、またはフォイルカバープレートでインキュベートする。
     
     
4. 一次抗体のために説明するように慎重にパラフィルムからカバースリップを取り除きます。細胞を2μg/ mlをヘキスト核PBSで希釈した染色（核の対比染色を優先する場合）で1分間のインキュベーションに続いて、PBSで2回、各時間5分を、洗う。ヘキスト染色した場合、古いですし、信号が弱過ぎないか、あなたは、インキュベーションの時間および/または濃度を増やすことができます。ヘキストとのインキュベーションの後、5分間PBSで1回洗浄する。
   
   
5. カバースリップを顕微鏡で可視化するためのマウントメディアとスライド上にマウントする必要があります。蛍光分子は、二次抗体の可視化のために使用されるケースでは、マウントメディアは退色最小限に抑えるために薬剤が含まれている必要があります。我々は、蛍光用の取り付けメディアとしてVectashieldを使用してください。顕微鏡スライド上にVectashieldの適切なサイズのドロップ（25 mmのカバースリップあたり12μlの、18mmのカバースリップあたり6μL、12 mmのカバースリップあたり3μl）を置きます。
   
   
6. 慎重にカバースリップをピックアップし、塩を（PBSから）削除するには、脱イオン水で背中を洗う。キムワイプまたはペーパータオルで余分な水分をオフDAB、とは下に向けてセルを持つVectashieldのドロップに横たわっていた。角度でカバースリップを置き、トラップの気泡を避けるために徐々に下降することができます。日付と任意のサンプル情報を使用してスライドにラベルを付けます。
   
   
7. カバーグラスとスライドはカバースリップの端の周りから（暗所で）過剰Vectashieldオフして吸引を乾燥することができます。必要に応じてカバースリップのエッジは今（カバーグラスを倒立顕微鏡で表示される場合に特に便利）、マニキュアで密封することができます。我々は通常、-20℃の冷凍庫に私たちのスライドを保存する。

Discussion

このプロトコルは、必要な抗体の量を最小限に抑え、信頼性の高い細胞の染色を与えるhNSPCsための免疫染色の手順を説明します。として説明する手順は、細胞内抗原に最適ですが、細胞表面分子を染色したり、細胞骨格の染色を高めるために変更することができます。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous