Summary
Une méthode de transfert de gènes pour le traitement de l'insuffisance cardiaque ischémique est décrit en utilisant un modèle porcin d'infarctus du myocarde. Notre méthode simple et reproductible nous permet de facilement évaluer l'efficacité des transferts de gènes différents avec une manière très simple et reproductible.
Abstract
Diverses nouvelles technologies sont développées pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque. Bien établies des évaluations précliniques sont nécessaires pour déterminer leur efficacité et leur sécurité.
La thérapie génique utilisant des vecteurs viraux est l'une des approches les plus prometteuses pour le traitement des maladies cardiaques. La livraison de divers gènes viraux différents en changeant le gène transporteur a incommensurable potentiel thérapeutique.
Dans cette vidéo, le processus complet d'un modèle animal de la création d'une insuffisance cardiaque suivie par transfert de gènes est présentée en utilisant un modèle porcin. Tout d'abord, l'infarctus du myocarde est créé par l'occlusion proximale antérieure descendante gauche l'artère coronaire. Résultats de remodelage cardiaque dans l'insuffisance cardiaque chronique. Unique à notre modèle est une cicatrice assez importante qui reflète véritablement les patients atteints d'insuffisance cardiaque grave et qui nécessitent un traitement agressif pour des résultats positifs. Après la création du myocarde infarctus et le développement de tissu cicatriciel, une injection intracoronaire de virus est démontrée avec une perfusion de nitroglycérine simultanée. Notre méthode d'injection permet le transfert de gène simple et efficace avec l'expression génétique. Cette combinaison d'un modèle d'infarctus du myocarde porcine avec la livraison intracoronarienne virus s'est avéré être une méthodologie cohérente et reproductible, ce qui permet non seulement de tester l'effet des gènes individuels, mais aussi de comparer l'efficacité de nombreux gènes comme des candidats thérapeutiques.
Protocol
1. Infarctus du myocarde création
- Femme porcs Yorkshire (20 kg) à partir des industries animales Biotech (Doylestown, PA) sont pré-médicamenteux en utilisant télazol (tilétamine / zolazépam) (8,0 mg / kg) et la buprénorphine (0,6 mg).
- Les animaux sont intubés et ventilés, puis avec de l'oxygène à 100%. L'anesthésie générale est maintenue avec du propofol (5-8mg/kg/hr) pendant toute la procédure.
- Le site du fémur est préparé avec de l'alcool isopropylique à 70% suivie par la polyvidone iodée. Une ponction percutanée permet d'accéder à l'artère et de placement de la gaine. Après l'insertion gaine, 3000-5000 UI d'héparine est administrée IV pour maintenir un temps de coagulation activé de 250-300 secondes.
- Un bolus d'amiodarone (75 mg) est administrée par voie intramusculaire. L'injection intraveineuse d'un sac de 1000 ml saline avec l'amiodarone (75 mg), l'atropine (2 mg), et l'acétate de potassium (20 mEq) est démarré et maintenu en utilisant un taux de 150 ml / h pendant toute la procédure.
- A 7 Fr crosse de hockey cathéter (Cordis; Miami, Floride) est avancé à l'artère coronaire gauche et une coronarographie est réalisée. Un fil guide 0.014 pouces (Abbott, Park, IL) est avancé dans la partie antérieure artère interventriculaire (DAL). Un 8-mm de long, 4,0 mm Voyager over-the-wire ballon (Abbott, Park, IL) est avancé et positionné à l'IVA proximale, et le ballon est gonflé à coronaires 3 atm. L'occlusion de l'artère interventriculaire antérieure est confirmée par angiographie.
- Avec l'électrocardiogramme en continu et la surveillance hémodynamique, l'occlusion est maintenue pendant 90 minutes. Arythmies ventriculaires malignes peuvent parfois se produire dans les 40 premières minutes, dans ce cas, la livraison immédiate des chocs directs actuels à partir de 200 J à 300 J sont administrés. Habituellement, il ya deux périodes de pointe de l'arythmie, l'un entre 2 et 10 minutes et l'autre entre 25 et 35 minutes après le gonflage du ballon. Surveillance diligente et défibrillation immédiate sont la clé de la création d'infarctus du myocarde avec succès, car il ya incidence de plus de 95% d'entrer au sein de la fibrillation ventriculaire les délais indiqués. Si la défibrillation immédiate et appropriée est effectuée, le taux de survie est très élevé. Si la pression artérielle diminue de moins de 80 mmHg, charge volumique est accomplie avec rapidité perfusion de solution saline par voie intraveineuse.
- Le ballon est dégonflé et tous les périphériques sont supprimés.
- La gaine est retirée de l'artère fémorale, l'anesthésie est retenu, et l'animal est surveillé pendant la récupération. Salines intraveineuse avec l'amiodarone, atropine et de la perfusion acétate de potassium est diminué à 50 ml / h et est donné pendant la nuit. Un des injections intramusculaires de Nitroglycerline et Furoscemide est administré. Puis l'animal est autorisé à récupérer et minutieuse surveillance ECG est poursuivie pendant au moins 3 heures.
- L'aspirine (200 mg) PO sera donnée pendant cinq jours.
Les complications communes durant et après la procédure de création d'infarctus du myocarde sont la dissection coronarienne, hématome site de ponction, l'arythmie et l'insuffisance cardiaque. Un affiner la technique et la surveillance minutieuse est nécessaire pour prévenir et gérer ces complications.
2. Injection du virus
- Les animaux sont préparés comme indiqué ci-dessus dans la création infarctus du myocarde steps1-3. La même dose d'héparine doit être donnée à prévenir la thrombose lors de l'injection du virus.
- Un cathéter bâton de hockey 5Fr (Cordis; Miami, Floride) est avancé à l'artère coronaire gauche. Après l'angiographie, deux des fils-guides 0,014 pouces sont avancés, l'un dans la DAL et un dans l'artère coronaire gauche circonflexe (LCX) pour fixer la position du cathéter.
- Le sang artériel (-20 ml) est tiré du cathéter. Pour éviter l'ischémie pendant la perfusion, la moitié du sang dilué est utilisé pour la solution. Le virus est mélangé avec 10 ml de sang et dilué à 20 ml avec une solution saline. Le solde de 10 ml est également dilué à 20 ml et utilisé offrir virus résiduel dans la lumière du cathéter.
- Nitroglycérine intraveineuse (20 mg / min) est lancé à travers la veine de l'oreille.
- L'extrémité du cathéter est placé à l'appareil principal proximal gauche. La pression à travers le cathéter est contrôlé pour s'assurer que le cathéter n'est pas de calage.
- Le sang du virus mixtes (15 ml) est injectée par le cathéter plus de 15 minutes en utilisant une pompe à perfusion dans l'artère coronaire gauche. Après 15 minutes, la seringue est échangé à la chasse d'eau, et la perfusion est poursuivie pendant 10 minutes.
- Un fil et un cathéter est fixé à l'artère coronaire droite la même manière que l'artère coronaire gauche.
- Le solde de 5 ml de sang mélangé avec le virus est injecté dans l'artère coronaire droite pendant 5 minutes suivies de 10 minutes de rinçage.
3. Cas représentatif
La figure 1 montre la ventriculographie gauche à 1 mois après la création d'infarctus du myocarde. Le mouvement du ventricule gauche mur est compromise de manière significative avec une fraction d'éjection (FE) de31%. La figure 2 montre les sections du ventricule gauche à 1 mois. Une grande cicatrice de la base au sommet de la paroi antérieure est vu. L'EF moyenne à un mois après un infarctus du myocarde dans ce modèle est de 36% et le volume moyen de fin de diastole est de 83 ml, alors que la moyenne de ceux de l'animal de même taille, sans un infarctus du myocarde est de 68% et 42 ml, respectivement. La figure 3 montre l'expression de la bêta-gal dans la région de zone ventriculaire gauche frontalière un mois après l'injection de virus adéno-associés (2 x 10 12 particules DNAse resitant des rAAV1 CMV Lac-Z). Une expression accrue a été trouvé dans la zone injectée le virus.
La fraction d'éjection Figure 1. Mesurée à partir ventriculographie gauche 1 mois après l'infarctus du myocarde de création. Ventricule gauche est dilaté à 92,5 ml et mouvement de la paroi antérieure est significativement altérée.
Figure 2. Les sections du ventricule gauche moins 1 mois après l'infarctus du myocarde de création, taché par du chlorure de triphényl tétrazolium pour délimiter la zone cicatricielle. Une grande cicatrice de la base au sommet de la paroi antérieure est vu.
Figure 3. Bêta-gal expression induite par le virus adéno-associés (2 x 10 12 particules DNase résistantes de rAAV1 CMV Lac-Z). Une expression accrue se trouve dans la zone de la zone frontière entre l'infarctus et le tissu normal, un mois après l'injection du virus intracoronaire. Photo de droite inférieure montre le contrôle négatif, où seule une solution saline normale a été injecté dans les artères coronaires utilisant le même protocole.
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Discussion
Parmi les différentes causes de l'insuffisance cardiaque, l'ischémie est de loin la plus fréquente dans l'étiologie. Pour surmonter cette grave maladie, différentes approches thérapeutiques sont en cours de développement. Évaluations soigneuses des thérapies sont nécessaires avant que ces thérapies prometteuses sont peut être appliquée à la clinique. Par conséquent, l'établissement d'un modèle d'insuffisance cardiaque ischémique, qui représente les conditions cliniques des patients est essentielle au développement des traitements de l'insuffisance cardiaque. Notre modèle d'infarctus du myocarde porcine répond à ces exigences translationnelle.
Pour induire une insuffisance cardiaque en créant un infarctus du myocarde, la zone de l'infarctus a besoin d'être grand. Notre modèle a une cicatrice plus large par rapport aux études précédentes qui ont également utilisé un modèle d'infarctus du myocarde endovasculaire 1. Nous avons constaté que l'administration de l'amiodarone et le maintien de la pression artérielle de plus de 80 mmHg pendant l'occlusion coronaire est essentiel d'augmenter le taux de survie à la fois et la zone d'infarctus. Alors que l'isoflurane est un anesthésique efficace pour cette procédure 1-2, nous avons constaté que le propofol, la pression artérielle plus élevée peut être maintenue. En outre, l'isoflurane est rapporté pour avoir plus d'effets cardio-protecteurs par rapport au propofol 3, et cela pourrait conduire à une diminution de la taille de l'infarctus.
Thérapie génique cardiaque est aujourd'hui l'une des approches les plus prometteuses à des défaillances cardiaques, et il ya diverses stratégies pour transférer le gène. Surtout, l'injection intracoronaire de vecteurs viraux porteurs d'un gène, est une technique simple et moins invasive. Diverses tentatives sont faites pour augmenter l'expression des gènes. Notre laboratoire a constaté que la nitroglycérine infuser pendant l'injection du virus augmente l'expression des gènes (I. Karakikes, inédit).
Le transfert de gènes d'SERCA2a utilisant adéno-associés vecteur viral a abouti à des résultats positifs chez les humains 4. D'autres améliorations à la thérapie génique cardiaque sont attendus avec des gènes transporteurs supplémentaires ainsi que les améliorations vecteur. Notre méthode de livraison offre de transfert de gène simple et efficace avec l'expression génétique, et peut être facilement traduit la clinique.
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Disclosures
Tous les auteurs ne sont pas des associations commerciales qui pourraient poser comme un conflit d'intérêts en rapport avec le manuscrit.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la Fondation Leducq à travers le réseau Caerus (RJH), par le NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 et P20HL100396 (RJH). DL a été soutenu par la Fondation allemande de recherche. Nous tenons à remercier Lauren Leonardson pour son aide technique dans ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
