A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Метод переноса генов для лечения ишемической сердечной недостаточности описывается с помощью свиного модели инфаркта миокарда. Наш простой и воспроизводимый метод позволяет легко оценить эффективность различных переводов гена с очень простым и воспроизводимым способом.

Abstract

Различные новые технологии разрабатываются для пациентов с сердечной недостаточностью. Налаженные доклинической оценки необходимы, чтобы определить их эффективность и безопасность.

Генная терапия с использованием вирусных векторов является одним из наиболее перспективных подходов для лечения сердечных заболеваний. Вирусный доставки различных различных генов путем изменения носителя гена неизмеримый терапевтический потенциал.

В этом видео, весь процесс животной модели сердца ошибки создания последующей передачи генов представлена ​​с помощью свиного модели. Во-первых, инфаркт миокарда создается окклюзии проксимальных левой передней нисходящей коронарной артерии. Сердце ремоделирования приводит к хронической сердечной недостаточности. Уникальный для нашей модели является довольно большой шрам, который действительно отражает пациентов с тяжелой сердечной недостаточностью, которые требуют агрессивной терапии для положительных результатов. После инфаркта миокарда создание и развитие рубцовой ткани, внутрикоронарного инъекции вируса продемонстрировали нитроглицерин с одновременным вливанием. Наши инъекционный метод обеспечивает простой и эффективный перенос генов с повышенной экспрессией генов. Эта комбинация инфаркта миокарда свиньи модель с внутрикоронарного доставки вирус оказался последовательным и воспроизводимым методология, которая помогает не только для проверки влияния отдельных генов, но и сравнить эффективность многих генов в качестве терапевтических кандидатов.

Protocol

1. Инфаркт миокарда создания Женский свиней Йоркшир (20 кг) из животных биотехнологической промышленности (Doylestown, ПА) уже лекарственное использованием Telazol (tiletamine / zolazepam) (8,0 мг / кг) и бупренорфин (0,6 мг). Животные интубированных и вентиляцию 100% кислородом. Общая анестезия поддерживается с Пропофол (5-8mg/kg/hr) на протяжении всей процедуры. Бедренной сайт подготовлен при 70% изопропиловый спирт затем повидон йод. Пункция чрескожная обеспечивает доступ к артерии и для оболочки размещения. После вставки оболочки, 3000-5000 МЕ гепарина вводят IV для поддержания активированного времени свертывания в 250-300 секунд. Болюсной дозы амиодарона (75 мг) вводят внутримышечно. Внутривенное введение 1000 мл физиологического раствора сумку с Амиодарон (75 мг), атропин (2 мг) и ацетата калия (20 мэкв) запускается и поддерживается использованием расчета 150 мл / ч на протяжении всей процедуры. 7 Fr клюшка катетер (Cordis, Майами, Флорида) является передовой для левой коронарной артерии и коронарной ангиографии не выполняется. 0,014-дюймовый проводник (Abbott, Парк, штат Иллинойс) является передовой в левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD). 8-мм длиной, 4,0-мм VOYAGER более-провод воздушный шар (Abbott, Парк, штат Иллинойс) является передовой и позиционируется в проксимальных LAD, и коронарной баллонной надувается до 3 атм. Окклюзия ЛАД подтверждается ангиографии. При непрерывном ЭКГ и мониторинга гемодинамики, окклюзия поддерживается в течение 90 минут. Злокачественные желудочковых аритмий могут время от времени происходят в течение первых 40 минут, и в этом случае немедленной поставки постоянного тока потрясения от 200 Дж до 300 Дж находятся в ведении. Обычно Есть два пика сроки аритмии, один от 2 до 10 минут, и другие от 25 до 35 минут после шар инфляции. Мониторинг Добросовестный и непосредственная дефибрилляции являются ключом к успешному созданию инфаркт миокарда, поскольку Есть более 95% случаев вхождения фибрилляции желудочков в сроки, указанные. Если немедленное и надлежащее дефибрилляции выполняется, выживаемость очень высока. Если артериальное давление падает ниже 80 мм рт.ст., объем нагрузки осуществляется при быстром внутривенном введении солевой инфузии. Спущенный воздушный шар, и все устройства будут удалены. Оболочка удаляется из бедренной артерии, анестезия удерживается, и животное отслеживается во время восстановления. Внутривенно солевых с Амиодарон, атропин и калия ацетат инфузии снижается на 50 мл / ч и дается за одну ночь. Внутримышечные инъекции Nitroglycerline и Furoscemide назначается. Затем животных допускается для восстановления и тщательный мониторинг ЭКГ продолжается не менее 3 часов. Аспирин (200 мг) ПО будет предоставлена ​​в течение пяти дней. Общие осложнения во время и после инфаркта миокарда процедуры создания являются коронарные рассечение, гематома места пункции, аритмии и сердечной недостаточности. Совершенствовать технику и тщательного мониторинга, необходимых для профилактики и лечения этих осложнений. 2. Вирус инъекций Животных готовят, как указано выше в инфаркт миокарда создания steps1-3. Же доза гепарина должна быть предоставлена ​​для предотвращения тромбоза во время вирус инъекции. 5Fr хоккейной клюшки катетер (Cordis, Майами, Флорида) является передовой для левой коронарной артерии. После ангиографии, два из 0,014-дюймовый провода руководстве, передовой, один в LAD и одна в левом огибающей коронарной артерии (LCX), чтобы исправить положение катетера. Артериальная кровь (-20 мл) взята из катетера. Для предотвращения ишемии во время вливания, наполовину разбавленной крови используется для решения. Вирус смешать с 10 мл крови и разбавляют до 20 мл физиологического раствора. Оставшиеся 10 мл также разбавляют до 20 мл и используется доставить остаточного вируса в просвет катетера. Внутривенный нитроглицерин (20 мкг / мин) запускается через ухо вены. Катетера помещен в проксимальных левого главных путей. Давлением через катетер контролироваться для обеспечения того, чтобы катетер не заклинивание. Вирус смешанной крови (15 мл) вводят через катетер в течение 15 минут с помощью инфузионного насоса в левой коронарной артерии. Через 15 минут шприц обменять на флеш, и инфузионных продолжают в течение 10 минут. Проволока и катетер крепят к правой коронарной артерии так же, как левой коронарной артерии. Остальные 5 мл крови смешивается с вирусом вводится в правой коронарной артерии в течение 5 минут, затем 10 минут флеш. 3. Представитель дело На рисунке 1 показана левая вентрикулография через 1 месяц после инфаркта миокарда создания. Левого движения стенки желудочка значительно нарушенной с фракцией выброса (ФВ) в31%. На рисунке 2 показаны сечения левого желудочка на 1 месяц. Большой шрам от основания к вершине передней стенки не наблюдается. Средний EF через 1 месяц после инфаркта миокарда в этой модели составляет 36%, а средний конечного диастолического объема составляет 83 мл, в то время как средняя из тех же размеров животного без инфаркта миокарда составляет 68% и 42 мл соответственно. На рисунке 3 показана экспрессия бета-гал в левой части пограничной зоны желудочка через 1 месяц после инъекции адено-ассоциированные вирусы (2 х 10 12 ДНКазы устойчивы частиц rAAV1 ЦМВ Лак-Z). Повышенной экспрессии был найден в области инъекции вируса. Рисунок 1. Фракция выброса измеряется от левого вентрикулография 1 месяц после инфаркта миокарда создания. Левый желудочек расширенные до 92,5 мл и переднего движения стенки значительно ухудшиться. Рисунок 2. Сечения левого желудочка через 1 месяц после инфаркта миокарда создания, окрашивали трифенил хлорида тетразолия очертить шрам области. Большой шрам от основания к вершине передней стенки не наблюдается. Рисунок 3. Бета-гал выражение индуцированного адено-ассоциированные вирусы (2 х 10 12 ДНКазы устойчивые частицы rAAV1 ЦМВ Лак-Z). Повышенной экспрессии находится в районе пограничной зоне между миокарда и нормальной тканью, через 1 месяц после инъекции вируса внутрикоронарного. Правый нижний рисунок показывает отрицательный контроль, где только физиологический раствор вводили в коронарных артериях, используя тот же протокол.

Discussion

Среди различных причин сердечной недостаточности, ишемии на сегодняшний день является наиболее частой в этиологии. Для преодоления этого серьезного заболевания, различные терапевтические подходы в настоящее время разрабатываются. Тщательная оценка терапии необходимы, прежде чем эт…

Materials

Telazol	Fort Dodge Animal Health	0856-9050-49
Propofol	APP Pharmaceuticals	63323-270-20
Heparin	APP Pharmaceuticals	63323-540-11
Amiodarone	APP Pharmaceuticals	63323-616-03
Atropin Sulfate	Med-Pharmex	54925-063-10
Potassium acetate	American Regent Inc.	2053-25
Nitroglycerine	American Regent Inc.	4810-25
Salix (Furosemide)	Intervet Inc.	710461
5 Fr Hockey stick catheter	Cordis	556-278-0L
7 Fr Hockey stick catheter	Cordis	778-278-00
Coronary wire	Abbott Laboratories	1044588
Coronary balloon	Abbott Laboratories	1009447-08
8Fr sheath	Terumo Medical Corp.	RSS801