Summary
허혈성 심장 마비의 치료를위한 유전자 전달의 방법은 심근 경색의 돼지 모델을 사용하여 설명합니다. 우리 간단하고 재현성 방법은 우리가 쉽게 매우 간단하고 재현성 방법으로 다양한 유전자 전송의 효능을 평가할 수 있습니다.
Abstract
다양한 새로운 기술은 심장 마비 환자에 대한 개발되고있다. 잘 설립 잠복기 평가는 효능과 안전성을 확인하기 위해 필요합니다.
바이러스성 벡터를 사용하여 유전자 치료는 심장 질환 치료를위한 가장 유망한 방법 중 하나입니다. 캐리어 유전자를 변경하여 여러 가지 유전자의 바이러스 배달 헤아릴 치료 가능성이있다.
이 비디오에서는 유전자 송금으로 다음 심장 마비 생성의 동물 모델의 전체 과정은 돼지 모델을 사용하여 제공됩니다. 첫째, 심근 경색은 관상 동맥을 내림차순 근위 왼쪽 앞쪽에을 occluding에 의해 생성됩니다. 만성 심장 마비에 심장 리모델링 결과. 우리의 모델 고유 정말 긍정적인 결과에 대한 공격적인 치료를 필요로 심각한 심장 마비 환자를 반영하는 상당히 큰 상처입니다. 후 심근 경색의 생성 및 반흔 조직의 개발, 바이러스의 intracoronary 주사는 동시 니트로 글리세린 주입과 증명합니다. 우리의 주입 방법은 향상된 유전자 발현과 함께 간단하고 효율적인 유전자 전달을 제공합니다. intracoronary 바이러스 전달과 함께 심근 경색 돼지 모델의 조합이 개별 유전자의 효과를 테스트하기 위해뿐만 아니라 도움이 일관성과 재현성 방법론,적일뿐만 아니라, 치료 후보로 많은 유전자의 효능을 비교했다.
Protocol
1. 심근 경색 생성
- 동물 생명 공학 산업 (도일 스타운, PA)에서 여성 요크셔 돼지 (20kg)는 Telazol (tiletamine / zolazepam) (8.0 밀리그램 / kg)과 Buprenorphine를 (0.6 MG)를 사용하여 미리 치료하고 있습니다.
- 동물 100 % 산소와 intubated 후 통풍이 있습니다. 전신 마취는 수술을 통해 Propofol (5-8mg/kg/hr)로 유지됩니다.
- 대퇴 사이트는 povidone 요오드 다음 70% 이소 프로필 알코올로 준비가되어 있습니다. percutaneous의 바늘이 동맥에 접근하고 칼집 배치에 대한을 제공합니다. 칼집 삽입 후, 헤파린의 3000-5000 IU는 2백50~3백초의 활성 응고 시간을 유지하기 위해 IV를 관리합니다.
- Amiodarone (75 MG)의 볼러스 선량은 intramuscularly 관리합니다. Amiodarone (75 MG), 아트로 핀 (2 MG) 및 칼륨 아세테이트 (20 mEq)와 1000 ML 호수 가방 정맥 주사가 시작 및 절차 전반에 걸쳐 150 ML / HR의 속도를 사용하여 유지됩니다.
- 7 천 하키 스틱 카테터는 (Cordis, 마이애미, FL) 왼쪽 관상 동맥 고급이며, 관상 동맥 혈관 조영술이 수행됩니다. 0.014 인치 가이드 와이어는 (애보트, 공원, IL) 관상 동맥을 내림차순 왼쪽 앞쪽에 (내사)에 고급입니다. 8 - mm 길이, 4.0 mm 보이저 이상 - 더 - 와이어 풍선이 (애보트, 공원, IL) 고급 위치 근위 내사과에서, 그리고 관상 동맥 풍선은 3 ATM에 부풀입니다. 그 소년의 폐색은 혈관 촬영으로 확인됩니다.
- 지속적인 심전도 모니터링 및 hemodynamic로 폐색 90 분 동안 유지됩니다. 악성 심실 arrhythmias는 종종 시행하는 경우에는 200 J에서 300 J로 직류 충격 즉시 배달을에, 처음 40 분 내에 발생할 수 있습니다. 보통 부정맥의 두 피크 시간 프레임 하나 둘 사이에 10 분, 풍선 인플레이션 이후 25 35분 사이에 다른있다. 프레임이 표시된 시간 내에 심실 세동을 입력 이상의 95 % 발생률이 있기 때문에 열심히 모니터링 및 즉각적인 defibrillation은 성공적인 심근 경색 생성하는 열쇠입니다. 즉각적이고 적절한 defibrillation이 수행되는 경우, 생존율은 매우 높습니다. 혈압 80 mmHg 이하로 떨어지면, 볼륨 부하가 빠른 정맥 주입 호수로 수행됩니다.
- 풍선 deflated하고 모든 장치가 제거됩니다.
- 칼집은 대퇴 동맥에서 제거, 마취가 원천 징수되고 동물은 복구하는 동안 모니터입니다. Amiodarone, Atropin 및 칼륨 아세테이트 주입과 정맥 호수 50 ML / 시간에서 감소하고 하룻밤 주어집니다. Nitroglycerline 및 Furoscemide의 근육내 주사가 관리합니다. 그러면 동물은 복구할 수 있으며,주의 ECG 모니터링은 최소한 3 시간 동안 계속됩니다.
- 아스피린 (200mg) PO는 5 일 동안 주어집니다.
심근 경색 생성 절차 도중 후 일반적인 합병증은 관상 동맥 절개, 펑크 사이트 혈종, 부정맥 및 심장 마비입니다. 기술을 보완하고 철저하게 모니터링은 이러한 합병증을 예방하고 관리해야합니다.
2. 바이러스 사출
- 위의 심근 경색 생성 steps1 - 3에 표시된 같은 동물은 준비가되어 있습니다. 헤파린의 동일한 복용량은 바이러스 주입 중에 혈전증을 방지하기 위해 제공해야합니다.
- 5Fr 하키 스틱 카테터는 (Cordis, 마이애미, FL) 왼쪽 관상 동맥 고급입니다. 혈관 촬영 후, 0.014 인치 가이드 와이어의 두 소년에 하나 카테터의 위치를 해결하기 위해 왼쪽의 곡절 악센트 관상 동맥 (누설 동축 케이블)을 한 고급 있습니다.
- 동맥혈 (-20 ML)은 카테터에서 얻을 수 있습니다. 주입하는 동안 국소 빈혈을 방지하기 위해, 절반은 희석 혈액이 솔루션에 사용됩니다. 바이러스 10 ML 혈액과 혼합과 호수가있는 20 ML로 희석합니다. 나머지 10 ML도 20 ML로 희석하여 카테 테르 루멘 내에 잔류 바이러스를 전달하는 데 사용됩니다.
- 정맥 주사 니트로 글리세린 (20 μg / 분)은 귀 정맥을 통해 시작됩니다.
- 카테 테르 팁은 근위 왼쪽 주요 트랙트에 배치됩니다. 카테터를 통해 압력은 카테 테르가 wedging되지 않도록 감시하고 있습니다.
- 바이러스 혼합 혈액 (15 ML)은 왼쪽 관상 동맥에 주입 펌프를 사용하여 십오분 통해 카테터를 통해 주입합니다. 십오분 후, 주사기가 빠질때로 교환하고, 주입은 10 분 동안 계속됩니다.
- 철사와 카테터는 바로 관상 동맥 왼쪽 관상 동맥과 같은 방법으로 해결됩니다.
- 바이러스와 혼합 혈액의 나머지 5 ML은 물을 10 분 다음 5 분 오른쪽 관상 동맥에 주입합니다.
3. 대표 사례
그림 1은 심근 경색 작성 후 일개월에서 왼쪽 ventriculography를 보여줍니다. 왼쪽 심실 벽의 운동이 크게의 배출 분율 (EF)와 장애인입니다31%. 그림 2는 일개월에서 좌심실의 교차 부분을 보여줍니다. 기지에서 앞쪽에 벽의 꼭대기에 큰 흉터를 볼 수 있습니다. 이 모델에서 심근 경색 후 일개월에서 평균 EF 36 %입니다 그리고 심근 경색없이 같은 크기의 동물 이들의 평균은 각각 68% 42 ML, 반면 평균 끝 diastolic 볼륨 83 ML이다. 그림 3의 왼쪽 심실 국경 지대 지역에서 베타 - 여자의 표현 adeno - 관련 바이러스 (CMV rAAV1 락 - Z 2 X 10 12 DNAse resitant 입자)의 주사 후 1 개월 보여줍니다. 강화된 표현은 바이러스 주입 지역에서 발견되었다.
그림 1. 분출 분율은 심근 경색 생성 후 일개월 왼쪽 ventriculography에서 측정. 좌심실은 92.5 ML로 확대되고 앞쪽에 벽 움직임이 크게 손상됩니다.
그림 2. triphenyl tetrazolium 염화 물들어 심근 경색 작성 후 일개월에서 좌심실의 교차 부분은 흉터 영역을 윤곽을 그리다 수 있습니다. 기지에서 앞쪽에 벽의 꼭대기에 큰 흉터를 볼 수 있습니다.
그림 3. adeno - 관련 바이러스 (CMV rAAV1 락 - Z 2 X 10 12 DNAse 강한 입자)에 의해 유도된 베타 여자의 표현. 강화된 표현은 intracoronary 바이러스 주사 후 경색과 정상 조직, 일개월 사이의 국경 지대 지역에서 발견된다. 오른쪽 하단 사진은 정상적인 생리가 동일한 프로토콜을 사용하여 관상 동맥에 주입했던 부정적인 컨트롤을 보여줍니다.
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Discussion
심장 마비의 다양한 원인 중 국소 빈혈은 멀리 가장 자주 병인에하는 것입니다. 이 심각한 질병을 극복하기 위해 다양한 치료 방법이 개발되고있다. 이러한 유망 치료법이 클리닉에 적용할 수있는 전에 요법의주의 평가가 필요합니다. 따라서, 환자의 임상 상태를 나타냅니다 허혈성 심부전 모델의 확립은 심장 마비의 요법의 발전에 중요합니다. 우리 돼지 심근 경색 모델이 translational 요구 사항을 충족.
심근 경색을 생성하여 심장 마비를 유발하기 위해서, 경색 지역 대형해야합니다. 우리의 모델은 또한 심근 경색 endovascular 모델 하나를 사용하여 이전 연구에 비해 더 큰 흉터가있다. 우리는 Amiodarone을 관리하고 관상 동맥 폐색 동안 80 mmHg 이상의 혈압을 유지하는 것은 생존의 속도와 경색 영역을 모두 향상에 필수적인 것으로 나타났습니다. Isoflurane이 절차 1-2를위한 효과적인 마취제이지만, 우리는 Propofol과 혈압이 유지 될 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, Isoflurane은 Propofol 3에 비해 더 심장 - 보호 효과를보고 있으며, 이것은 경색의 크기 감소로 이어질 수 있습니다.
심장의 유전자 치료는 이제 심장 장애에 가장 유망한 접근법 중 하나이며, 유전자를 전송하는 전략을 다양한있다. 무엇보다도 유전자를 나르는 바이러스 벡터의 intracoronary 주입은 간단하고 덜 침입 기술입니다. 다양한 시도가 유전자 발현을 증가 만들어집니다. 우리 연구실은 바이러스 주입하는 동안 니트로 글리세린을 일으키는 것은 유전자 발현 (I. Karakikes, 게시되지 않은)를 증가시킬 수있다는 것을 발견했습니다.
adeno - 관련 바이러스 벡터를 사용하여 SERCA2a의 유전자 전달은 인간 4 긍정적인 결과 초래했다. 심장 유전자 치료에 더 개선 추가 캐리어 유전자뿐만 아니라 벡터 상세로 예상된다. 우리의 배달 방법은 향상된 유전자 발현과 함께 간단하고 효율적인 유전자 전달을 제공하고, 쉽게 병원을 번역하실 수 있습니다.
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Disclosures
모든 저자는 원고와 관련하여 관심의 충돌로 포즈 수도 상업적인 연관이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 및 P20HL100396 (RJH)에 의해, Caerus 네트워크 (RJH)를 통해 Leducq 재단에서 지원됩니다. DL는 독일 연구 재단에 의해 지원되었다. 우리는이 프로젝트에 그녀의 기술 지원 로렌 Leonardson 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
