Summary
Un metodo di trasferimento genico per il trattamento dell'insufficienza cardiaca ischemica è descritta utilizzando un modello suino di infarto miocardico. Il nostro metodo semplice e riproducibile ci permette di valutare rapidamente l'efficacia dei trasferimenti di geni diversi, con un modo molto semplice e riproducibile.
Abstract
Diverse tecnologie emergenti si stanno sviluppando per i pazienti con insufficienza cardiaca. Consolidate valutazioni precliniche sono necessari per determinare la loro efficacia e sicurezza.
La terapia genica mediante vettori virali è uno degli approcci più promettenti per il trattamento di malattie cardiache. Consegna virale di vari geni diversi modificando il gene trasportatore è incommensurabile potenziale terapeutico.
In questo video, l'intero processo di un modello animale di insufficienza cardiaca creazione seguita da trasferimento di geni è presentato con un modello suina. In primo luogo, infarto del miocardio è stato creato da occlusione della discendente anteriore sinistra prossimale delle arterie coronarie. Rimodellamento cardiaco risultati nell'insufficienza cardiaca cronica. Unico per il nostro modello è una cicatrice abbastanza grande, che rispecchia in pieno i pazienti con grave insufficienza cardiaca che richiedono una terapia aggressiva per i risultati positivi. Dopo infarto miocardico creazione e lo sviluppo di tessuto cicatriziale, una iniezione intracoronarica di virus è dimostrato con simultanea infusione di nitroglicerina. Il nostro metodo d'iniezione prevede il trasferimento di geni semplice ed efficiente con l'espressione genica migliorata. Questa combinazione di un modello di infarto del miocardio suina con consegna intracoronarica virus ha dimostrato di essere una metodologia coerente e riproducibile, che aiuta non solo a testare l'effetto di singoli geni, ma anche di confrontare l'efficacia di molti geni candidati terapeutici.
Protocol
1. Infarto miocardico creazione
- Femmina maiali Yorkshire (20kg) da Animal Industries Biotech (Doylestown, PA) sono pre-medicati con Telazol (tiletamina / zolazepam) (8,0 mg / kg) e Buprenorfina (0,6 mg).
- Gli animali sono intubati e ventilati con ossigeno al 100%. L'anestesia generale viene mantenuta con Propofol (5-8mg/kg/hr) durante tutta la procedura.
- Il sito del femore è preparato con il 70% di alcool isopropilico seguita da iodio povidone. Una puntura percutanea fornisce l'accesso a l'arteria e per il posizionamento della guaina. Dopo l'inserimento della guaina, 3000-5000 UI di eparina viene somministrata per via endovenosa per mantenere un tempo di coagulazione attivato di 250-300 secondi.
- Una dose bolo di amiodarone (75 mg) viene somministrato per via intramuscolare. L'iniezione endovenosa di una borsa da 1000 ml soluzione fisiologica con Amiodarone (75 mg), atropina (2 mg), e acetato di potassio (20 mEq) viene avviato e mantenuto utilizzando un tasso di 150 ml / h per tutta la procedura.
- Un Fr. 7 hockey-stick catetere (Cordis, Miami, FL) è avanzata per l'arteria coronaria sinistra e una angiografia coronarica viene eseguita. A 0,014 pollici filo guida (Abbott Park, IL) è avanzato in discendente anteriore dell'arteria coronarica (LAD). Un 8-mm di lunghezza, 4,0 mm VOYAGER over-the-wire pallone (Abbott Park, IL) è avanzata e posizionato al LAD prossimale, e il palloncino coronarico è gonfiato a 3 atm. Occlusione della discendente anteriore è confermata da angiografia.
- Con elettrocardiogramma continuo e monitoraggio emodinamico, l'occlusione viene mantenuta per 90 minuti. Aritmie ventricolari maligne possono occasionalmente verificarsi entro i primi 40 minuti, nel qual caso la consegna immediata di diretta attuali shock da 200 a 300 J J vengono somministrati. Di solito ci sono due intervalli di tempo di picco di aritmia, uno tra i 2 ei 10 minuti e l'altra tra i 25 ei 35 minuti dopo il gonfiaggio del palloncino. Monitoraggio diligente e defibrillazione immediata sono fondamentali per la creazione di successo infarto miocardico, poiché ci sono oltre il 95% l'incidenza di entrare in fibrillazione ventricolare entro il tempo indicato cornici. Se la defibrillazione immediata e sia eseguito correttamente, il tasso di sopravvivenza è molto alto. Se la pressione sanguigna scende al di sotto di 80 mmHg, il volume di carico si ottiene con una rapida infusione endovenosa salina.
- Il palloncino viene sgonfiato e tutti i dispositivi vengono rimossi.
- La guaina viene rimossa dal arteria femorale, l'anestesia è trattenuto, e l'animale viene monitorato durante il recupero. Salina per via endovenosa con Amiodarone, atropina e infusione acetato di potassio è diminuita a 50 ml / h ed è dato durante la notte. Un iniezioni intramuscolari di Nitroglycerline e Furoscemide viene somministrato. Poi l'animale è permesso di recuperare e attento monitoraggio ECG è continuata per almeno 3 ore.
- Aspirina (200 mg) PO sarà dato per cinque giorni.
Comuni complicazioni durante e dopo la procedura di creazione infarto miocardico sono dissezione coronarica, ematoma nel sito di puntura, aritmia e insufficienza cardiaca. Un affinare la tecnica e monitoraggio completo è necessario per prevenire e gestire queste complicanze.
2. Virus iniezione
- Gli animali sono preparati come sopra indicato nella creazione infarto miocardico steps1-3. La stessa dose di eparina deve essere somministrato a prevenire la trombosi durante l'iniezione del virus.
- Un catetere 5Fr bastone da hockey (Cordis, Miami, FL) è avanzata per l'arteria coronaria sinistra. Dopo l'angiogramma, due di 0,014 pollici fili guida sono avanzati, uno in KOP e uno nella sinistra dell'arteria coronaria circonflessa (LCX) per fissare la posizione del catetere.
- Sangue arterioso (-20 ml) viene prelevato dal catetere. Per evitare che l'ischemia durante l'infusione, la metà del sangue diluito viene utilizzato per la soluzione. Il virus è mescolato con 10 ml di sangue e diluito a 20 ml con soluzione fisiologica. Il restante 10 ml è diluito a 20 ml e usate fornire virus residuo all'interno del lume del catetere.
- Nitroglicerina per via endovenosa (20 mg / min) viene avviato attraverso la vena orecchio.
- La punta del catetere è posizionato a sinistra del tratto prossimale principale. La pressione attraverso il catetere è controllato per garantire che il catetere non è incastro.
- Il sangue del virus misti (15 ml) viene iniettato attraverso il catetere più di 15 minuti usando una pompa per infusione nella coronaria sinistra. Dopo 15 minuti, la siringa è scambiato per il colore, e infusione continua per 10 minuti.
- Un filo e un catetere sono fissati a destra dell'arteria coronaria allo stesso modo di sinistra dell'arteria coronaria.
- Il restante 5 ml di sangue misto con il virus viene iniettato nell'arteria coronaria destra per 5 minuti seguita da 10 minuti di filo.
3. Rappresentante Caso
La figura 1 mostra la ventricolografia sinistra a 1 mese dopo la creazione infarto del miocardio. Il movimento della parete ventricolare sinistra è significativamente compromessa con una frazione di eiezione (EF)Il 31%. La figura 2 mostra le sezioni del ventricolo sinistro a 1 mese. Una cicatrice di grandi dimensioni dalla base all'apice della parete anteriore è visto. L'obiettivo EF media a 1 mese dopo infarto miocardico in questo modello è il 36% e il volume diastolico finale medio è di 83 ml, mentre la media di quelli nello stesso animale di dimensioni senza un infarto miocardico è del 68% e 42 ml, rispettivamente. La figura 3 mostra l'espressione di beta-gal nella sinistra zona zona di confine ventricolare 1 mese dopo l'iniezione di virus adeno-associato (2 x 10 12 particelle DNAsi resitant di rAAV1 CMV Lac-Z). Una maggiore espressione è stata trovata nella zona di iniezione del virus.
Espulsione Figura 1. Frazione misurata dalla ventricolografia sinistra 1 mese dopo la creazione di infarto miocardico. Ventricolo sinistro è dilatato a 92,5 ml e movimento della parete anteriore è significativamente compromessa.
Figura 2. Le sezioni del ventricolo sinistro a 1 mese dopo la creazione di infarto del miocardio, macchiato da cloruro di trifeniltetrazolo a delineare l'area cicatriziale. Una cicatrice di grandi dimensioni dalla base all'apice della parete anteriore è visto.
Figura 3. Beta-gal espressione indotta da virus adeno-associato (2 x 10 12 particelle DNAsi resistenti di CMV rAAV1 Lac-Z). Una maggiore espressione si trova in zona di frontiera tra la zona di infarto e il tessuto normale, 1 mese dopo l'iniezione intracoronarica virus. Foto in basso a destra mostra il controllo negativo, in cui è stata iniettata solo soluzione salina normale nelle arterie coronarie utilizzando lo stesso protocollo.
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Discussion
Tra le varie cause di insufficienza cardiaca, ischemia è di gran lunga la più frequente in eziologia. Per superare questa grave malattia, diversi approcci terapeutici sono stati sviluppati. Attente valutazioni delle terapie sono necessarie prima di queste terapie promettenti possono essere applicate alle cliniche. Pertanto, la creazione di un modello di insufficienza cardiaca ischemica che rappresenta le condizioni cliniche dei pazienti è fondamentale per lo sviluppo di terapie insufficienza cardiaca. Il nostro modello di infarto del miocardio suina soddisfa questi requisiti traslazionale.
Per indurre insufficienza cardiaca con la creazione di un infarto del miocardio, l'area di infarto deve essere grande. Il nostro modello ha una cicatrice più ampia rispetto agli studi precedenti che ha anche utilizzato un modello di infarto del miocardio endovascolare 1. Abbiamo scoperto che la somministrazione di amiodarone e il mantenimento della pressione sanguigna oltre 80 mmHg durante l'occlusione coronarica è essenziale per aumentare sia il tasso di sopravvivenza e la zona dell'infarto. Mentre isoflurano è un anestetico efficace per questa procedura 1-2, abbiamo scoperto che con Propofol, la pressione sanguigna più alta può essere mantenuta. Inoltre, isoflurano è segnalato per avere più effetti cardio-protettivi rispetto al Propofol 3, e questo potrebbe portare a una dimensione ridotta dei infarto.
Terapia genica cardiaca è oggi uno degli approcci più promettenti per insufficienza cardiaca, e ci sono varie strategie per trasferire il gene. Soprattutto, l'iniezione intracoronarica di vettori virali portatrice di un gene, è una tecnica semplice e meno invasiva. Vari tentativi sono fatti per aumentare l'espressione genica. Il nostro laboratorio ha scoperto che infusione di nitroglicerina durante l'iniezione del virus aumenta l'espressione genica (I. Karakikes, inedito).
Il trasferimento genico di SERCA2a con adeno-associato vettore virale ha portato a risultati positivi negli esseri umani 4. Ulteriori miglioramenti alla terapia genica cardiaca sono attesi con i geni vettore supplementare così come perfezionamenti vettore. Il nostro metodo di consegna prevede il trasferimento di geni semplice ed efficiente con l'espressione genica migliorata, e può essere facilmente tradotto nella clinica.
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Disclosures
Tutti gli autori non hanno associazioni commerciali che potrebbero rappresentare come un conflitto di interessi in relazione con il manoscritto.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalla Fondazione Leducq attraverso la rete Caerus (RJH), dal NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 e P20HL100396 (RJH). DL è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Vorremmo ringraziare Lauren Leonardson per l'assistenza tecnica in questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
