Summary
En metod för genöverföring för behandling av ischemisk hjärtsvikt beskrivs med ett svin modell av hjärtinfarkt. Våra enkel och reproducerbar metod som gör att vi snabbt utvärdera effekten av olika genöverföringar med ett mycket enkelt och reproducerbart sätt.
Abstract
Olika ny teknik utvecklas för patienter med hjärtsvikt. Väletablerade prekliniska utvärderingar är nödvändiga för att fastställa deras effekt och säkerhet.
Genterapi med hjälp av virala vektorer är en av de mest lovande metoderna för behandling av hjärtsjukdomar. Viral leverans av flera olika gener genom att ändra den bär på samma gen har omätliga terapeutisk potential.
I den här videon är till fullo delta i en djurmodell av hjärtsvikt skapande följt av genöverföring presenteras med hjälp av ett svin modell. För det första är hjärtinfarkt skapat av blockerade den proximala vänster främre nedstigande kranskärl. Hjärta ombyggnad resulterar i kronisk hjärtsvikt. Unikt för vår modell är en ganska stor ärr som verkligen återspeglar patienter med svår hjärtsvikt som kräver aggressiv behandling för positiva resultat. Efter hjärtinfarkt etablering och utveckling av ärrvävnad, är en intrakoronar injektion av virus påvisas med samtidig nitroglycerin infusion. Vår injektion metod ger enkel och effektiv genöverföring med förbättrad genuttryck. Denna kombination av en hjärtinfarkt svin modell med intrakoronar virus leverans har visat sig vara ett konsekvent och reproducerbart metoder, vilket bidrar inte bara för att testa effekten av enskilda gener, men också jämföra effekten av många gener som terapeutiska kandidater.
Protocol
1. Hjärtinfarkt skapande
- Kvinna Yorkshire svin (20 kg) från Animal Biotech Industries (Doylestown, PA) är premedicineras med Telazol (tiletamine / zolazepam) (8,0 mg / kg) och Buprenorfin (0,6 mg).
- Djur är intuberade och sedan ventileras med 100% syre. Generell anestesi upprätthålls med Propofol (5-8mg/kg/hr) under hela förfarandet.
- Den femorala webbplats är förberedd med 70% isopropylalkohol följt av povidonjodid. En perkutan punktion ger tillgång till artären och slida placering. Efter slida insättning är 3000-5000 IE heparin administrerat IV för att upprätthålla en aktiverad koagulation tid 250-300 sekunder.
- En bolusdos på Amiodaron (75 mg) ges intramuskulärt. Intravenös injektion av en 1000 ml koksaltlösning väska med Amiodaron (75 mg), atropin (2 mg), och kaliumacetat (20 mekv) startas och upprätthålls med hjälp av en hastighet av 150 ml / timme under hela förfarandet.
- En 7 Fr hockey-stick-kateter (Cordis, Miami, FL) är långt till vänster kranskärl och en koronarangiografi utförs. En 0,014-tums guidekabel (Abbott, Park, IL) är avancerade i vänster främre nedstigande kranskärl (LAD). En 8-mm lång, 4,0 mm VOYAGER over-the-wire är ballong (Abbott, Park, IL) avancerade och placerade på den proximala LAD, och koronar ballongen är uppblåst till 3 ATM. Ocklusion av LAD bekräftas av angiografi.
- Med kontinuerlig EKG och hemodynamisk monitorering är ocklusion bibehålls i 90 minuter. Maligna ventrikulära arytmier kan ibland uppträda inom de första 40 minuterna, då omedelbar leverans av likström stötar från 200 J 300 J administreras. Vanligtvis finns det två topp tidsramar för arytmi, en mellan 2 och 10 minuter och den andra mellan 25 och 35 minuter efter ballongen inflationen. Omsorgsfull övervakning och omedelbar defibrillering är nyckeln till en framgångsrik hjärtinfarkt skapande, eftersom det finns mer än 95% incidens av in kammarflimmer inom tidsramar anges. Om den omedelbara och lämpliga defibrillering sker, är överlevnaden mycket hög. Om blodtrycket sjunker under 80 mmHg, är volymen belastning uppnås med snabb intravenös saltlösning infusion.
- Ballongen är tömd och alla enheter är borttagna.
- Manteln är bort från lårbensartären är anestesi inne, och djuret övervakas under återhämtning. Intravenös saltlösning med amiodaron, atropin och kaliumacetat infusion minskar vid 50 ml / tim och ges över en natt. En intramuskulär injektion av Nitroglycerline och Furoscemide ges. Då djuret får återhämta sig och noggrann EKG-övervakning fortsätter i minst 3 timmar.
- Aspirin (200mg) PO kommer att ges i fem dagar.
Vanliga komplikationer under och efter hjärtinfarkt skapandet förfarandet koronar dissektion, punktionsstället hematom, arytmi och hjärtsvikt. En förfina teknik och noggrann övervakning för att förebygga och hantera dessa komplikationer.
2. Virus Injection
- Djuren är beredda enligt ovan i hjärtinfarkt skapandet steps1-3. Samma dos av heparin bör ges för att förhindra trombos under viruset injektionen.
- En 5Fr hockeyklubba kateter (Cordis, Miami, FL) är långt till vänster kranskärl. Efter angiogram, två av 0,014 tum guidekablar är avancerade, en i LAD och en i vänster cirkumflex kranskärl (LCX) för att fixera positionen av katetern.
- Arteriellt blod (-20 ml) dras från katetern. För att förhindra att ischemi under infusionen är halv utspätt blod som används för lösning. Viruset blandas med 10 ml blod och späds till 20 ml med koksaltlösning. De återstående 10 ml är också utspädd till 20 ml och används leverera kvarvarande viruset inom katetern lumen.
- Intravenöst nitroglycerin (20 mikrogram / min) startas genom örat ven.
- Kateterspetsen är placerad på den proximala vänster främsta tarmkanalen. Trycket via katetern kontrolleras för att säkerställa att katetern inte är fasthållning.
- Viruset blandat blod (15 ml) injiceras genom katetern över 15 minuter med en infusionspump i vänster kranskärl. Efter 15 minuter är sprutan byts till färgen, och infusionen fortsätter i 10 minuter.
- En tråd och en kateter är fasta till höger kranskärl på samma sätt som vänster kranskärl.
- Resterande 5 ml blod blandas med virus injiceras i höger kranskärl i 5 minuter följt av 10 minuters spolning.
3. Representant i mål
Figur 1 visar den vänstra ventrikulografiska vid 1 månad efter hjärtinfarkt skapelsen. Den vänstra kammarens vägg rörelse är signifikant nedsatt med en ejektionsfraktion (EF) i31%. Figur 2 visar tvärsnitt av vänster kammare vid 1 månad. Ett stort ärr från basen till toppen av den främre väggen syns. Den genomsnittliga EF vid 1 månad efter hjärtinfarkt i den här modellen är 36% och den genomsnittliga slutet diastoliska volymen är 83 ml, medan genomsnittet för de i samma storlek djuret utan en hjärtinfarkt är 68% och 42 ml. Figur 3 visar ett uttryck för beta-gal i vänster kammare gränszonen område 1 månad efter injektion av Adeno-associerade virus (2 x 10 12 DNAse resitant partiklar av rAAV1 CMV Lac-Z). En förbättrad uttryck hittades i viruset injicerade området.
Figur 1. Ejektionsfraktion mätt från vänster ventrikulografiska 1 månad efter hjärtinfarkt skapelse. Vänster kammare är vidgade till 92,5 ml och främre vägg rörelse är betydligt nedsatt.
Figur 2. Tvärsnitt av vänster kammare vid 1 månad efter hjärtinfarkt skapelse, färgas av trifenyl tetrazoliumklorid att avgränsa ärret området. Ett stort ärr från basen till toppen av den främre väggen syns.
Figur 3. Beta-gal uttryck inducerad av Adeno-associerade virus (2 x 10 12 DNAse resistenta partiklar av rAAV1 CMV Lac-Z). En förbättrad uttryck finns på gränszonen området mellan infarkten och den normala vävnaden, 1 månad efter intrakoronar viruset injektion. Höger nedre bilden visar den negativa kontrollen, där endast vanlig koksaltlösning injicerades i hjärtats kranskärl med hjälp av samma protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bland de olika orsakerna till hjärtsvikt är ischemi i särklass mest frekventa i etiologi. För att övervinna denna allvarliga sjukdom, finns olika terapeutiska metoder utvecklas. Noggrann utvärderingar av behandlingar krävs innan dessa lovande behandlingar kan tillämpas på klinikerna. Därför är inrättandet av en ischemisk hjärtsvikt modell som representerar det kliniska tillstånd hos patienter avgörande för utvecklingen av behandlingar hjärtsvikt. Vår svin hjärtinfarkt modell uppfyller dessa translationell krav.
Att inducera hjärtsvikt genom att skapa en hjärtinfarkt behöver infarkt området vara stora. Vår modell har en större ärr jämfört med tidigare studier som också används en endovaskulär hjärtinfarkt modell 1. Vi har funnit att administrera Amiodaron och upprätthålla blodtryck över 80 mmHg under koronar ocklusion är viktigt att öka både överlevnad och infarkt området. Medan Isofluran är ett effektivt bedövningsmedel för detta förfarande 1-2, fann vi att med Propofol, kan högre blodtryck upprätthållas. Dessutom är Isofluran rapporteras ha mer hjärt-skyddande effekter jämfört med Propofol 3, och detta kan leda till en minskad storlek på hjärtinfarkt.
Hjärtat genterapi är nu en av de mest lovande metoderna för hjärtsvikt, och det finns olika strategier för att överföra genen. Framför allt intrakoronar injektion av virala vektorer som bär en gen, är en enkel och mindre invasiv teknik. Olika försök görs för att öka genuttryck. Vårt laboratorium har funnit att ingjuta nitroglycerin under viruset injektionen ökar genuttryck (I. Karakikes, opublicerad).
Genöverföring av SERCA2a använda Adeno-associerad viral vektor har resulterat i positiva resultat hos människor 4. Ytterligare förbättringar av hjärt genterapi förväntas med ytterligare bärare gener samt förfiningar vektor. Vår leverans metod ger enkel och effektiv genöverföring med förbättrad genuttryck, och kan lätt översättas kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inga kommersiella föreningar som kan utgöra en intressekonflikt i samband med manuskript.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Leducq stiftelsen genom Caerus nätverk (RJH), genom NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 och P20HL100396 (RJH). DL stöddes av den tyska Research Foundation. Vi vill tacka Lauren Leonardson för henne tekniskt stöd i detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
