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Medicine

Ischemic हृदय में विफलता के लिए एक preclinical मॉडल में जीन स्थानांतरण

Published: May 15, 2011 doi: 10.3791/2778

Summary

Ischemic हृदय की विफलता के इलाज के लिए जीन स्थानांतरण का एक तरीका myocardial infarction के एक सूअर मॉडल का उपयोग करने के लिए वर्णित है. हमारी सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि हमें एक बहुत ही सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके के साथ आसानी से विभिन्न जीन स्थानांतरण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

विभिन्न उभरती प्रौद्योगिकियों दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए विकसित किया जा रहा हैं. अच्छी तरह से स्थापित preclinical मूल्यांकन उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं.

जीन थेरेपी वायरल vectors का उपयोग कर हृदय रोगों के इलाज के लिए सबसे होनहार दृष्टिकोण है. विभिन्न विभिन्न जीनों की वाहक जीन बदलकर वायरल डिलीवरी अथाह चिकित्सीय क्षमता है.

इस वीडियो में, जीन स्थानांतरण के बाद दिल की विफलता के निर्माण का एक पशु मॉडल की पूरी प्रक्रिया एक सूअर मॉडल का उपयोग कर प्रस्तुत किया है. सबसे पहले, रोधगलन प्रॉक्सिमल बाईं कोरोनरी धमनी अवरोही पूर्वकाल occluding के द्वारा बनाई गई है. हार्ट क्रोनिक दिल विफलता में remodeling परिणाम है. हमारे मॉडल के लिए अद्वितीय है एक काफी बड़ा निशान है जो वास्तव में गंभीर दिल विफलता के साथ रोगियों को जो सकारात्मक परिणाम के लिए आक्रामक उपचार की आवश्यकता होती है दर्शाता है. दौरे रोधगलितांश निर्माण और निशान ऊतक के विकास के बाद, वायरस के एक intracoronary इंजेक्शन युगपत nitroglycerine जलसेक के साथ प्रदर्शन किया है. हमारे इंजेक्शन विधि बढ़ाया जीन की अभिव्यक्ति के साथ सरल और कुशल जीन स्थानांतरण प्रदान करता है. Intracoronary वायरस वितरण के साथ एक दौरे रोधगलितांश स्वाइन मॉडल के इस संयोजन के लिए एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति है, जो न केवल व्यक्ति के जीन के प्रभाव का परीक्षण करने में मदद करता है होना सिद्ध किया है, लेकिन यह भी चिकित्सीय उम्मीदवार के रूप में कई जीनों की प्रभावकारिता की तुलना.

Protocol

1. Myocardial रोधगलितांश सृजन

  1. पशु बायोटेक इंडस्ट्रीज (Doylestown, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) से महिला यॉर्कशायर सूअरों (20kg) पूर्व औषधीय Telazol (tiletamine / zolazepam) (8.0 मिलीग्राम / किग्रा) और buprenorphine (0.6 मिलीग्राम) का उपयोग कर रहे हैं.
  2. पशु intubated और तब 100% ऑक्सीजन के साथ हवादार. सामान्य संज्ञाहरण Propofol (5-8mg/kg/hr) के साथ प्रक्रिया भर में बनाए रखा है.
  3. ऊरु साइट 70% isopropyl शराब povidone आयोडीन द्वारा पीछा के साथ तैयार है. Percutaneous पंचर धमनी तक पहुँच और म्यान प्लेसमेंट के लिए प्रदान करता है. म्यान प्रविष्टि के बाद, हेपरिन की 3000-5000 IU चतुर्थ प्रशासित किया जाता है एक सक्रिय की जमावट 250-300 सेकंड के समय को बनाए रखने.
  4. Amiodarone (75 मिलीग्राम) की एक सांस में खुराक intramuscularly प्रशासित किया जाता है. Amiodarone (75 मिलीग्राम), atropine (2 मिलीग्राम), और पोटेशियम एसीटेट (20 एमईक्यू) के साथ एक 1000 मिलीलीटर खारा बैग के अंतःशिरा इंजेक्शन शुरू कर दिया है और प्रक्रिया के दौरान 150 मिलीग्राम / घंटा की दर का उपयोग करने के लिए बनाए रखा.
  5. एक 7 फादर हॉकी छड़ी कैथेटर (कोर्डिस, मियामी, FL) छोड़ दिया कोरोनरी धमनी के लिए उन्नत है और एक कोरोनरी एंजियोग्राफी किया जाता है. गाइड 0.014 इंच तार (Abbott, पार्क, आईएल) छोड़ दिया कोरोनरी धमनी अवरोही पूर्वकाल (लाड) में उन्नत है. एक 8 मिमी लंबे, 4.0 मिमी-over उन्नत तार गुब्बारा (Abbott, पार्क, आईएल) और प्रॉक्सिमल लाड पर तैनात है, और कोरोनरी गुब्बारा एटीएम 3 करने के लिए फुलाया जाता है मल्लाह. लाड की आड़ एंजियोग्राम द्वारा की पुष्टि की है.
  6. निरंतर इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और hemodynamic निगरानी के साथ, रोड़ा 90 मिनट के लिए बनाए रखा है. घातक ventricular arrhythmias कभी कभी पहले 40 मिनट के भीतर हो सकता है, जो 200 जम्मू से 300 जम्मू प्रत्यक्ष वर्तमान झटके के तत्काल वितरण के मामले में प्रशासित रहे हैं. आमतौर पर वहाँ दो अतालता के पीक समय फ्रेम, एक 2 के बीच और 10 मिनट और अन्य गुब्बारा मुद्रास्फीति के बाद 25 और 35 मिनट के बीच हैं. मेहनती निगरानी और तत्काल defibrillation सफल दौरे रोधगलितांश निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वहाँ समय फ्रेम संकेत के भीतर ventricular fibrillation में प्रवेश के 95% से अधिक की घटना. यदि तत्काल और उचित defibrillation प्रदर्शन है, जीवित रहने की दर बहुत अधिक है. यदि रक्तचाप 80 mmHg के तहत बूँदें, मात्रा लोड तेजी से नसों खारा जलसेक के साथ पूरा किया है.
  7. गुब्बारा पिचकाकर है और सभी उपकरणों को हटा रहे हैं.
  8. म्यान और्विक धमनी से निकाल दिया जाता है, संज्ञाहरण पर रोक लगाई है, और जानवरों की वसूली के दौरान निगरानी की है. Amiodarone, Atropin और पोटेशियम एसीटेट जलसेक के साथ अंतःशिरा खारा 50 मिलीलीटर / घंटा में कमी आई है और रात भर दिया है. Nitroglycerline और Furoscemide के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन प्रशासित किया जाता है. तब जानवर को ठीक करने की अनुमति दी है और सावधान ईसीजी निगरानी में कम से कम 3 घंटे के लिए जारी रखा है.
  9. एस्पिरिन पीओ (200mg) पांच दिनों के लिए दिया जाएगा.

दौरे रोधगलितांश रचना प्रक्रिया के दौरान और बाद में आम जटिलताओं कोरोनरी विच्छेदन, पंचर साइट रक्तगुल्म, अतालता, और दिल की विफलता हैं. एक तकनीक को परिष्कृत और पूरी तरह से निगरानी इन जटिलताओं को रोकने के लिए और प्रबंधन के लिए आवश्यक है.

2. वायरस इंजेक्शन

  1. जानवरों के रूप में दौरे रोधगलितांश सृजन steps1 3 में उपर्युक्त तैयार हैं. वायरस इंजेक्शन के दौरान घनास्त्रता रोकने के हेपरिन की एक ही खुराक दी जानी चाहिए.
  2. एक 5Fr हॉकी स्टिक कैथेटर (कोर्डिस, मियामी, FL) बाईं कोरोनरी धमनी के लिए उन्नत है. एंजियोग्राम के बाद, 0.014 इंच गाइड तारों के दो उन्नत कर रहे हैं, और लाड में एक छोड़ दिया सिकमफ़्लक्स कोरोनरी धमनी (LCX) कैथेटर की स्थिति को ठीक करने के लिए में.
  3. धमनी रक्त कैथेटर (-20 मिलीलीटर) से तैयार की है. जलसेक दौरान ischemia रोकने के आधा पतला रक्त समाधान के लिए प्रयोग किया जाता है. वायरस 10 मिलीलीटर रक्त के साथ मिश्रित है और नमक के साथ 20 मिलीलीटर के लिए पतला. शेष 10 मिलीलीटर 20 मिली भी पतला है और कैथेटर लुमेन भीतर अवशिष्ट वायरस देने के लिए इस्तेमाल किया.
  4. अंतःशिरा नाइट्रोग्लिसरीन (20 μg / मिनट) कान नस के माध्यम से शुरू कर दिया है.
  5. कैथेटर टिप प्रॉक्सिमल बाईं मुख्य पथ पर रखा गया है. कैथेटर के माध्यम से दबाव करने के लिए सुनिश्चित करें कि कैथेटर नहीं wedging है के लिए नजर रखी है.
  6. वायरस मिश्रित रक्त (15 मिलीलीटर) कैथेटर के माध्यम से बाईं कोरोनरी धमनी में एक जलसेक पंप का उपयोग कर 15 मिनट पर इंजेक्शन है. 15 मिनट के बाद, सिरिंज फ्लश करने के लिए बदल जाता है, और जलसेक 10 मिनट के लिए जारी है.
  7. एक तार और एक कैथेटर सही कोरोनरी धमनी के लिए छोड़ दिया कोरोनरी धमनी के रूप में एक ही रास्ता तय कर रहे हैं.
  8. वायरस के साथ मिश्रित रक्त के शेष 5 मिलीलीटर 5 फ्लश के 10 मिनट के द्वारा बाद मिनट के लिए सही कोरोनरी धमनी में अंतःक्षिप्त है.

3. प्रतिनिधि प्रकरण

चित्रा 1 दौरे रोधगलितांश सृजन के बाद 1 महीने में छोड़ दिया ventriculography से पता चलता है. एक इंजेक्शन के अंश (एफई) के साथ छोड़ दिया ventricular दीवार गति काफी बिगड़ा हुआ है31%. चित्रा 2 1 महीने में बाएं वेंट्रिकल के पार वर्गों से पता चलता है. आधार से पूर्वकाल दीवार के शीर्ष के लिए एक बड़ा निशान देखा है. इस मॉडल में रोधगलन के बाद 1 महीने में औसत एफई 36% और औसत अंत डायस्टोलिक मात्रा 83 मिलीलीटर है, जबकि एक myocardial infarction के बिना एक ही आकार के जानवर में उन लोगों के औसत 68% और 42 मिलीलीटर, क्रमशः है. चित्रा 3 बीटा छोड़ दिया ventricular सीमा क्षेत्र क्षेत्र में लड़की की अभिव्यक्ति एडिनो - जुड़े वायरस (2 एक्स 10 12 rAAV1 Lac-Z सीएमवी के DNase resitant कणों) के इंजेक्शन के बाद 1 महीने से पता चलता है. एक बढ़ाया अभिव्यक्ति वायरस इंजेक्शन क्षेत्र में पाया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1 इंजेक्शन फ्रैक्शन बाईं ventriculography से 1 महीने मापा दौरे रोधगलितांश सृजन के बाद. बाएं वेंट्रिकल 92.5 मिलीलीटर तक फैली हुई है और पूर्वकाल दीवार गति काफी बिगड़ा हुआ है.

चित्रा 2
चित्रा 2. दौरे रोधगलितांश सृजन के बाद एक महीने में बाएं वेंट्रिकल triphenyl tetrazolium क्लोराइड द्वारा दाग के पार वर्गों निशान क्षेत्र चित्रित करने के लिए. आधार से पूर्वकाल दीवार के शीर्ष के लिए एक बड़ा निशान देखा है.

चित्रा 3
चित्रा 3. बीटा लड़की एडिनो - जुड़े वायरस (2 एक्स 10 12 rAAV1 Lac-Z सीएमवी के DNase प्रतिरोधी कणों) द्वारा प्रेरित अभिव्यक्ति. एक बढ़ाया अभिव्यक्ति रोधगलन और intracoronary वायरस के इंजेक्शन के बाद सामान्य ऊतकों, 1 महीने के बीच सीमा क्षेत्र के क्षेत्र में पाया जाता है. निचले सही तस्वीर नकारात्मक नियंत्रण है, जहां केवल सामान्य नमक कोरोनरी धमनियों में इंजेक्ट किया गया था एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखाता है.

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Discussion

दिल की विफलता के विभिन्न कारणों के अलावा, ischemia एटियलजि में अब तक का सबसे अक्सर है. इस गंभीर बीमारी पर काबू पाने के लिए, विभिन्न चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित किया जा रहा है. उपचारों की सावधानी से मूल्यांकन से पहले इन आशाजनक उपचार कर सकते हैं क्लीनिकों के लिए लागू किया जा आवश्यक हैं. इसलिए, एक ischemic हृदय विफलता मॉडल है कि रोगियों के नैदानिक ​​स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है की स्थापना दिल की विफलता के उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. हमारी स्वाइन दौरे रोधगलितांश मॉडल में इन translational आवश्यकताओं को पूरा करता है.

एक myocardial infarct बनाने के द्वारा दिल की विफलता प्रेरित करने के लिए, रोधगलितांश क्षेत्र के लिए बड़ा हो सकता है की जरूरत है है. हमारा मॉडल एक बड़ा निशान जो भी एक endovascular दौरे रोधगलितांश एक मॉडल का इस्तेमाल किया पिछले अध्ययनों की तुलना में है. हमने पाया है कि Amiodarone प्रशासन और कोरोनरी रोड़ा के दौरान 80 mmHg से अधिक रक्तचाप को बनाए रखने दोनों जीवित रहने की दर और रोधगलितांश क्षेत्र में वृद्धि के लिए आवश्यक है. जबकि Isoflurane इस 1-2 प्रक्रिया के लिए एक प्रभावी संवेदनाहारी है, हमने पाया है कि Propofol साथ, उच्च रक्तचाप बनाए रखा जा सकता . इसके अलावा, Isoflurane 3 Propofol की तुलना में हृदय सुरक्षात्मक प्रभाव है की सूचना दी है, और इस infarction के एक कम आकार करने के लिए नेतृत्व सकता है.

कार्डिएक जीन थेरेपी अब एक हृदय विफलताओं को सबसे होनहार दृष्टिकोण के, और रणनीतियों के विभिन्न प्रकार के जीन स्थानांतरण कर रहे हैं. सब के ऊपर, वायरल वैक्टर एक जीन ले जाने के intracoronary इंजेक्शन, एक साधारण और कम इनवेसिव तकनीक है. विभिन्न प्रयास करने के लिए जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए बना रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला में पाया गया है कि वायरस के इंजेक्शन के दौरान नाइट्रोग्लिसरीन infusing जीन की अभिव्यक्ति (मैं Karakikes, अप्रकाशित) बढ़ जाती है.

4 मनुष्यों में SERCA2a जीन स्थानांतरण एडिनो - जुड़े वायरल सदिश का उपयोग सकारात्मक परिणामों में हुई है . अतिरिक्त वाहक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीन वेक्टर शोधन के साथ हृदय की जीन थेरेपी के लिए आगे सुधार की उम्मीद कर रहे हैं. हमारे वितरण पद्धति बढ़ाया जीन की अभिव्यक्ति के साथ सरल और कुशल जीन स्थानांतरण प्रदान करता है, और आसानी से क्लिनिक अनुवाद कर सकते हैं.

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Disclosures

सभी लेखकों कोई व्यावसायिक संघों है कि ब्याज की एक संघर्ष के रूप में पांडुलिपि के साथ कनेक्शन में आ सकती है.

Acknowledgments

इस काम Leducq फाउंडेशन द्वारा Caerus नेटवर्क (RJH) के माध्यम से NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156, और P20HL100396 (RJH) द्वारा समर्थित है. डीएल जर्मन रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. हम उसे इस परियोजना में तकनीकी सहायता के लिए लॉरेन Leonardson धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Telazol Fort Dodge Animal Health 0856-9050-49
Propofol APP Pharmaceuticals 63323-270-20
Heparin APP Pharmaceuticals 63323-540-11
Amiodarone APP Pharmaceuticals 63323-616-03
Atropin Sulfate Med-Pharmex 54925-063-10
Potassium acetate American Regent Inc. 2053-25
Nitroglycerine American Regent Inc. 4810-25
Salix (Furosemide) Intervet Inc. 710461
5 Fr Hockey stick catheter Cordis 556-278-0L
7 Fr Hockey stick catheter Cordis 778-278-00
Coronary wire Abbott Laboratories 1044588
Coronary balloon Abbott Laboratories 1009447-08
8Fr sheath Terumo Medical Corp. RSS801

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References

  1. Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
  2. Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
  3. Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
  4. Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).

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मेडिसिन 51 अंक myocardial infarction जीन थेरेपी intracoronary इंजेक्शन वायरल सदिश है Ischemic दिल की विफलता
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Ishikawa, K., Ladage, D., Tilemann,More

Ishikawa, K., Ladage, D., Tilemann, L., Fish, K., Kawase, Y., Hajjar, R. J. Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model. J. Vis. Exp. (51), e2778, doi:10.3791/2778 (2011).

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