Lentiviruses هي أداة بحث قيما لاستكشاف وظائف الجينات ، إلا أن الباحثين قد ترغب في تجنب إنتاج ترميز الفيروسة البطيئة شمولي التوجه المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم. كبديل ، نقدم أكثر أمانا لاستخدام بروتوكول الفيروسة البطيئة ecotropic على الخلايا البشرية المعدلة للتعبير عن mSlc7a1 مستقبلات ecotropic.
الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية دراسات غالبا ما تتطلب تنبيغ الفيروسية من الخلايا البشرية والجينات المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، ورفع القضايا الرئيسية لسلامة العاملين في المختبرات. lentiviruses شمولي التوجه ، مثل pseudotype VSV – G شيوعا ، هي أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات لأنها يمكن أن تنبيغ أنواع الخلايا عديدة ، بما في ذلك الخلايا غير الانقسام. ومع ذلك ، قد ترغب في تجنب الباحثين الإنتاج والطرد من الفيروسات المسرطنة ترميز شمولي التوجه نتيجة لارتفاع مستوى متطلبات السلامة الأحيائية المناولة وقضايا السلامة. ومن المعروف المسرطنة قوية عدة ، بما في ذلك C – Myc وSV40 المستضد T كبيرة ، لتعزيز إنتاج يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSC). كل أخرى معروفة iPSC الذي يحفز التغيرات الجينية (OCT4 ، SOX2 ، KLF4 ، NANOG ، LIN28 ، وفقدان وظيفة البروتين p53) وأيضا وصلات إلى السرطان ، مما يجعلها ذات الاهتمام سلامة عالية نسبيا أيضا.
في حين أن هذه الفيروسات المرتبطة بالسرطان مفيدة في دراسة إعادة برمجة الخلايا وتعدد القدرات ، لا بد من استخدامها بأمان. لمعالجة هذه القضايا المتعلقة بالسلامة الأحيائية ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتنبيغ الخلايا البشرية ecotropic الفيروسة البطيئة ، مع التركيز على خفض تكلفة إضافية والمناولة المريحة. أنتجنا الفيروسة البطيئة ecotropic مع عيار مرتفع بما فيه الكفاية لتنبيغ أكبر من 90 ٪ من الخلايا المستقبلة للتعبير عن الإنسان يتعرض للفيروس ، والتحقق من فعالية هذا النهج.
ويتركز أغلب الأحيان بواسطة تنبيذ فائق الفيروسة البطيئة ، ولكن هذه العملية تستغرق عدة ساعات ويمكن ان تنتج الهباء المعدية للباحثين الطب الحيوي الإنسان. كما يمكن أن يكون بديلا ، والجسيمات الفيروسية بأمان أكبر الرسوبية على الخلايا complexation مع كبريتات شوندروتن وpolybrene (CS / PB). هذا الأسلوب يزيد من عيار الفيروسية وظيفية تصل إلى أضعاف 3 في خلايا الفئران ستابلي التعبير عن مستقبلات الفيروس الارتجاعي ، مع تذكر الوقت المحتسب بدل الضائع والتكاليف. ومما يعزز من الحد الأقصى تنبيغ الخلايا الليفية الجلد البشري (HDFs) باستخدام CS / PB تركيزات ما يقرب من 4 أضعاف أقل من القيمة المثلى ذكرت سابقا لخطوط الخلايا السرطانية ، مما يوحي معاير ينبغي أن تركيز البوليمر لنوع من الخلايا المستهدفة من الفائدة. وصفنا ذلك استخدام بروميد methylthiazolyldiphenyl – tetrazolium (MTT) لفحص للسمية البوليمر في نوع من الخلايا الجديدة. نلاحظ بقاء يعادل HDFs بعد تنبيغ الفيروسية باستخدام البوليمر complexation أو جرعة قياسية من polybrene (PB ، 6 ميكروغرام / مل) ، مشيرا إلى الحد الأدنى من السمية الحادة.
في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام الفيروسة البطيئة لecotropic overexpression من الجينات المسرطنة في الخلايا البشرية ، والحد من مخاطر السلامة البيولوجية وزيادة معدل تنبيغ. نظهر أيضا استخدام complexation البوليمر لتعزيز تنبيغ مع تجنب تشكيل الهباء الطرد المركزي من الجسيمات الفيروسية.
ودرس المؤتلف gammaretrovirus ecotropic استنادا فيروس ابيضاض الدم الفأري مولوني (MLV) ومستقبلات mSlc7a1 لها جيدا وعلى نطاق واسع ، بعد أن استخدمت لأكثر من 20 عاما لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الفئران. كما تم استخدام أكثر gammaretrovirus Ecotropic مؤخرا لتقديم المسرطنة إلى الخلايا البشرية ؛ في سياق إعادة برمجة الخلايا ، واستخدام mSlc7a1 لتجنب توليد فيروس amphotropic بايواء المسرطنة الإنسان راسخة 4،5 ومع ذلك ، الفيروسة البطيئة يوفر مزايا هامة على gammaretrovirus transducing السكان في خلية صهر (6) ، بما في ذلك الخلايا الأولية التي غالبا ما تكون الأهداف المرغوب فيه لإعادة البرمجة ، وذلك لأن lentiviral قبل الاندماج المعقدة تسمح للخلايا تنبيغ عدم تقسيم 7
وقد تم إنتاج Lentiviruses مع العشرات من pseudotypes مختلفة ، بما في ذلك MLV ، في محاولة لتغيير tropism الفيروس ، والسمية ، وغيرها من الممتلكات. استخدمت 8 الفيروسة البطيئة ecotropic MLV – pseudotyped لتنبيغ خلايا فأر ، 9 ولكن نادرا ما كانت تستخدم على الخلايا البشرية 10 لذلك نحن نقترح استخدام MLV – pseudotyped الفيروسة البطيئة ecotropic كوسيلة آمنة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الكفاءة لتقديم المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، بما في ذلك عوامل إعادة برمجة الخلايا ، والخلايا البشرية.
فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا البروتوكول لا تقضي تماما على الحاجة إلى إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة شمولي التوجه ، بل يفصل بين هذا البروتوكول الجين الورمي (ق) من الفيروس شمولي التوجه ، وعزل باحثون من امكاناتها الذاتية التلقيح مع السرطان المرتبطة الفيروسات. وأعرب بتواجد مطلق في mSlc7a1 البروتين وhSlc7a1 لها نديد الإنسان نقل الأحماض الأمينية مع عدم وجود tumorigenicity معروفة أو القدرة على منح ميزة انتقائية على نمو خلايا المتلقي ، 11 mSlc7a1 صنع منخفضة المخاطر نسبيا لإدراجها في amphotropic الفيروس. هذه الخطوة قد تكون مفيدة بشكل خاص وأضاف في المختبرات تفتقر إلى مرافق مخصصة أو الفيروس زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية المطلوبة.
في بعض الحالات قد يكون من الممكن أن تقضي تماما على استخدام فيروس شمولي التوجه من قبل وtransfecting Slc7a1 البلازميد مباشرة إلى الخلايا المستهدفة ، إلا أن العديد من الخلايا التي من شأنها أن تكون مفيدة لأهداف هذه التقنية أيضا لصهر ترنسفكأيشن. كبديل ، والقدرة على عزل الخلايا Slc7a1 – transduced عن طريق الانتقاء blasticidin الوسائل التي يمكن استخدامها VSV – G الفيروسة البطيئة pseudotyped مرة واحدة لإنشاء مخزون من خلايا مستقبلات معربا عن بعد والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني لفيروس ecotropic تنبيغ هذه الخلايا بالنسبة لكثير التجارب. وينبغي أن تتبع دائما المبادئ التوجيهية الباحثين سلامتهم المؤسسية للعمل مع أي الفيروسة البطيئة ، بغض النظر عن tropism والخمسين.
التتر من فيروس ecotropic يتحقق مع هذا البروتوكول هي أقل نسبيا من VSV – pseudotyped الفيروس ، عادة 10-20 ٪ من عيار الفيروس شمولي التوجه ، بالاتفاق مع الدراسات السابقة. قيست 9 هذه التتر في الخلايا البشرية transduced ستابلي مع Slc7a1 ، وبالتالي فإن انخفاض وقد لاحظ لفيروس عيار ecotropic أن يعزى ذلك جزئيا إلى التعبير متنوعة من الجين في مستقبلات الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، فإن التتر الفيروسية التي تحققت في بروتوكول لدينا هي أكثر من كافية بالنسبة لمعظم التطبيقات ، وتؤدي إلى تنبيغ غالبية الخلايا ، في بعض الحالات> 90 ٪ من الخلايا.
ويشيع استخدام التقنيات المعتمدة على الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية. ويمكن استخدام ومع ذلك ، تتطلب عدة ساعات الطرد المركزي ، ويولد الهباء المعدية ، ويمكن أن يتسبب في خسائر كبيرة من الجزيئات الفيروسية (12). وكبديل ، مع complexation CS / PB لتعزيز تنبيغ دون تغيير tropism الفيروسية. 3 هذا الأسلوب السريع (5 دقائق ) وغير مكلفة (0.03 دولار للفيروس مل 10) ، في حين أن ثلاثة أمثالها تقريبا عيار ملاحظتها. وهناك حاجة إلى معدات خاصة أو الكواشف الملكية ، لاحظنا والحد الأدنى من السمية الحادة بعد التعرض للHDFs إلى CS / PB ، بالاتفاق مع الأعمال السابقة في خطوط الخلايا الأخرى. 13 عيب واحد المحتملة لهذا البروتوكول هو أن بعض مرئية المجهر مجمعات البوليمر التمسك الخلايا لعدة أيام في الثقافة. لا يمكننا استبعاد احتمال ان هذه المجمعات ، في حين لا علنا السامة للخلايا ، قد يكون لها آثار أكثر مكرا على العمليات الخلوية.
هنا قد وصفنا منهجية لبأمان وكفاءة الخلايا البشرية transducing مع عوامل أنكجنيك. هذا النهج ينبغي أن تكون ذات فائدة كبيرة للباحثين الذين يدرسون الجينات المسرطنة وبيولوجيا الخلايا الجذعية بما في ذلك خلايا الجذع.
The authors have nothing to disclose.
وقدم التمويل لهذا المشروع من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
pCMV-dR8.91 | D. Trono lab14 | Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) | |
pHCMV-EcoEnv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
Fugene HD | Roche | 04 709 705 001 | |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
Blasticidin S | Fisher | BP 2647100 | |
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |