Summary
מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.
Abstract
בכל שנה, מאות אלפי חולים לעבור ניתוח מעקפים בעורק בארצות הברית. 1 כשליש מהחולים הללו אין כלי מתאים התורם עצמיים בשל התקדמות המחלה או הקציר הקודם. מטרתה של הנדסת רקמות כלי דם היא לפתח מקור חלופי מתאים אלה שתלי לעקוף. בנוסף, רקמת כלי דם מהונדסים עשויים להביא תועלת כמו החיים דגמים של כלי הדם כדי לחקור מחלות לב וכלי דם. מספר גישות מבטיחות לכלי הדם הנדסה נחקרו, עם מחקרים עדכניים רבים מתמקדת בפיתוח וניתוח של תא המבוססת על שיטות. 2-5 בזאת, אנו מציגים שיטה במהירות עצמית להרכיב תאים לטבעות רקמה 3D כי ניתן להשתמש במבחנה למודל רקמות כלי דם.
כדי לעשות זאת, השעיות של בתאי שריר חלק הם זורעים לתוך עגול תחתית טבעתי agarose בארות. לא דבק המאפיינים של agarose לאפשר הבתאי הדואר להתיישב, המצרפי חוזה סביב לפרסם במרכז היטב כדי ליצור טבעת רקמה מלוכדת. 6,7 טבעות אלה יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים לפני קציר מכני עבור ניתוח, פיזיולוגית ביוכימית או היסטולוגית. הראינו כי אלה תאים שמקורם ברקמה טבעות התשואה על 100-500 כוח kPa האולטימטיבי מתיחה 8 אשר עולה על הערך דיווח על אחרים מהונדסים בונה רקמת כלי דם בתרבית לתקופות דומות (<30 kPa). 9,10 התוצאות שלנו מראות כי תאים חזקים הנגזרות דור וסקולרית טבעת רקמה יכולה להיות מושגת בתוך פרק זמן קצר, והיא מציעה את ההזדמנות להערכה כמותית ישירה של תרומות של תאים תאים שמקורם מטריצה (CDM) על מבנה רקמת תפקוד כלי הדם.
Protocol
1. זריעת Cell עובש ייצור
בגין על ידי כרסום 1 / 2 "חתיכה עבה של פוליקרבונט כדי ליצור 15, תחתית עגולה, בארות טבעתי בקוטר מרכז שלאחר מ"מ 2. ערוצי הסתובבו הם 6 מ"מ עמוקה 3.75 מ"מ רחב. נקי ויבש את התבנית כדי פוליקרבונט להסיר את כל פסולת הפלסטיק תהליך הטחינה.
מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) בשעה 10:01 יחס (w / w) בסיס לסוכן ריפוי, דגה כדי להסיר את כל בועות האוויר, ויוצקים על התבנית פוליקרבונט. דגה שוב כדי להסיר בועות הנותרים, ולרפא בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
נרפא פעם, להסיר בזהירות את התבנית על ידי PDMS לאט לקלף אותה הרחק פוליקרבונט, לשטוף עם סבון ומים, החיטוי. כמו כן החיטוי פתרון של שתי אחוזים agarose (w / v) מומס שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM).
מניחים את התבנית PDMS על משטח ישר ומלא עם האגא מותך עלה על ידי הראשון pipetting agarose לתוך כל אחד תבניות הודעה המרכז, ולאחר מכן pipetting לחלל סביבו. אפשר agarose כדי לבסס (כ 15 דקות), ואז להפוך את התבנית כדי לשחרר את agarose מן PDMS. גזור agarose עודף סביב כל אחת הבארות, והמקום בארות לתוך 12-agarose גם הצלחות.
2. Cell תרבות זריעת טבעת
הוסף תרבית תאים מדיה (DMEM עם 10% ו -1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין) סביב החלק החיצוני של התבנית agarose, ללא מכסה את החלק העליון של תבניות. מקמי את הצלחות בחממה ולאפשר להם לאזן במשך כ 15 דקות תוך כדי להכין את התאים.
באותו מפגש 90%, trypsinize אבי העורקים חולדה חלקה שריר תאים (rSMCs) ו resuspend בריכוז של 5x10 6 תאים / מ"ל. פיפטה 100 μL ההשעיה לתוך תא אחד טבעתי agarose בארות, בתנועות מעגליות כדי להחיל התאים היטב כל אחד.
תוכן "> ודא המדפים חממה הן ברמה, אז במקום צלחות בחממה ולאפשר להם לשבת באין מפריע במשך 24 שעות. מדיום חליפין כל יומיים לאחר מכן על ידי aspirating התקשורת מרחבי היטב, מילוי מחדש כל טוב עד agarose גם הוא שקוע לגמרי.3. טבעת רקמה קציר ומדידות עובי
בסיומו של תרבות, להסיר את הטבעת עובש agarose ידי הזזה זה מעל לפרסם את המרכז.
מניחים את הטבעת בצלחת פטרי קטנה עם פוספט בופר סליין (PBS), במרכז המדגם, לרכוש תמונה באמצעות מערכת ההדמיה הדיגיטלית.
השתמש ניתוח התמונה בתוכנית לאיתור קצה ולמדוד את עובי הטבעת ב 4 עמדות (למעלה, למטה, ימינה ושמאלה) סביב היקפו. חשב את ערך עובי ממוצע (t) עבור כל טבעת הפרט, להשתמש כדי לחשב את ערך שטח חתך(2π (t / 2) 2).
4. בדיקה מכנית של טבעות
הגדרת מכונה בדיקות מתיחה (Instron EPS 1000) במצב אופקי. צרף תא 1N ± 1mN לטעון אישית אוחז חוט דק (שנוצר על ידי כיפוף חוט נירוסטה).
הר מדגם הטבעת על שני אוחזת חוט דק. הרחבת להתמודד עד עומס 5 mn טרה מוחל על המדגם. הזן את שטח חתך (מחושבים ממדידות עובי) ולהקליט את אורך מד.
טרום מחזור טבעות 8 פעמים בין לטעון את טרה ו 50 מתח kPa בשיעור של 10 מ"מ / דקה. לאחר השמיני טרום מחזור, למשוך לכישלון של 10 מ"מ / דקה. כישלון הוא כאמור ירידה בכוח על ידי 40% מן מדידה אחד למשנהו. עבור כל דגימה טבעת, למדוד את הלחץ מתיחה האולטימטיבי (UTS) ומתח כישלון לחשב את המקסימום משיק מודולוס (MTM) מהנתונים רכשה.
5. רקמות כמו טבעתsembly לפברק צינורות רקמה
מחזיקי צינור מותאמות אישית במכונה מסיבוב 5 דיסקים ס"מ פוליקרבונט עם מגזרות מלבני (2 ס"מ X 3 ס"מ). לקדוח חורים מושחל דרך דיסקים אלה לאפשר לשני בעלי להידפק יחד. החיטוי בעלי שפופרת אישית, ולאחר מכן להעביר לממשלה biosafety ומניחים צלחת פטרי ריקות.
השתמש במספריים כירורגית לחתוך את הקצוות של 1.9 מ"מ קוטר צינורות סיליקון בזווית כדי ליצור שוליים משופעים, ולאחר מכן החיטוי צינורות סיליקון. בעוד צינורות נמצאים autoclaved, למלא צלחת פטרי עם התקשורת.
הסר את טבעות מבארות agarose ומניחים אותם בצלחת פטרי עם התקשורת. המקום autoclaved צינורות סיליקון בצלחת פטרי אותו כדי להרטיב אותם לפני השימוש.
שימוש במלקחיים למקום בסוף משופעים של שפופרת סיליקון למרכז טבעת בעדינות להחליק את הטבעת על צינורות הסיליקון. חזור עם המספר הרצוי של רימהה. החלק את טבעות במגע אחד עם השני על ידי בעדינות לדחוף אותם ברציפות בשני הכיוונים לאורך הצינור. שיטה זו יכולה לשמש עבור טבעות שנקטפו אחרי יום אחד בלבד בתרבות.
ברגע טבעות מורכבים, ליישר צינורות סיליקון בתוך מחזיקי פוליקרבונט בורג שני החלקים של בעל יחד. המקום מחזיק בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ ולהוסיף 55 מ"ל התקשורת. שערי המדיה כל 3 ימים למשך תרבות.
כדי להסיר את צינורות רקמות, לשחרר את צינורות סיליקון מבעל פוליקרבונט להשתמש במלקחיים כדי להחליק את צינורות רקמה את צינור סיליקון לתוך צלחת פטרי מלאות PBS.
6. נציג תוצאות:
כאשר פרוטוקול מבוצע כראוי, מצטבר בתאים ליצירת טבעות רקמה בקוטר פנימי שווה לקוטר של הפוסט את התבנית המתאימה בתוך 24 שעות. קצוות הטבעת הן בדרך כלל חלק במראה (אם culturעורך על משטח ישר), הם אחידים בעובי סביב ההיקף כולו. הטבעות רקמה קל לטפל ניתן להסיר מבארות שלהם לניתוח מכני היסטולוגית לאחר מכן (ראה ב Gwyther et al. 2011 8). טבעת רקמה מורפולוגיה, הרכב מטריצה, תכונות מכניות להשתנות בהתאם למספר וסוג של תאים שנזרעו.
תוצאות נציגת טבעות רקמה עשוי סוגי תאים שונים, זריעת התנאים, אורך תרבות מוצגים בלוח 1. שתי טבעות זהות מ"מ שנוצרו 5x10 5 rSMCs הציג UTS גבוה יותר מאשר טבעות שנוצרו שפורסמו בעבר שלנו 2 טבעות מ"מ (עשוי 6.6x10 5 rSMCs). 8 דומים לתאי עכברוש, אדם לתאי שריר חלק (hSMC) בקלות מצטברים כדי ליצור רקמות טבעות, שהכיל כמות גדולה של קולגן רק לאחר 14 ימים בתרבות (מידע לא מוצג). אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) מצטברים גם ויצרו טבעות מלוכדת, אך להחוזק מכני cked ושבר במהלך שלבי precycling הראשוני של בדיקות מתיחה uniaxial.
| n | תא מספר | עובי (מ"מ) | אורך של התרבות (ימים) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | אי זן (מ"מ / מ"מ) | |
| rSMC טבעות | 6 | 660000 | 0.94 ± 0.12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0.50 ± 0.08 |
| rSMC טבעות | 4 | 500000 | 0.53 ± 0.02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0.88 ± 0.05 |
| hSMC טבעות | 3 | 750000 | 0.51 ± 0.05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0.92 ± 0.08 |
| hMSC טבעות | 3 | 750000 | 0.40 ± 0.07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
טבלה 1. טבלה המציגה את הפרמטרים תרבות תכונות מכניות של 2 מ"מ טבעות שנוצר סוגי תאים שונים, ריכוזי זריעה, ואת משכי תרבות.
באיור 1. (א) סכמטי של תהליך טבעת רקמה דור. (ב) מותאם אישית פוליקרבונט עם עובש בארות טבעתי מחורץ. בקטרים הודעה המרכזית הם 2 מ"מ. (ג) PDMS התבנית לאחר התקלף מן התבנית פוליקרבונט. (ד) טבעת רקמה מצטבר עובש בתרבית agarose עם הודעה של 2 מ"מ. (ה) שני מ"מ רקמה בקוטר הטבעת PBS. ברים סולם = 6 מ"מ (B, C) ו 2 מ"מ (D, E).
באיור 2. העלילה נציג מתח מתח עקומת produCED מניסוי מתיחה uniaxial.
Discussion
לאחרונה חלה התעניינות מוגברת מבוססי תאים או "פיגום פחות" הנדסת רקמות שיטות כדי לטפל בכמה מגבלות פיגום מבוססי גישות הנדסת רקמות. בהתחשב בכך תאים שמקורם ברקמות נוצרות בתאים המטריצה שהם מייצרים, הם מטבעם מכילים הרבה יותר גבוה צפיפות התא, אינם מכילים חומרים אקסוגניים, והוא יכול להיות עשוי כולו מ תאים חלבונים אנושיים. שתלי כלי דם העשויים תאים אנושיים יכולים להשיג חוזק מכני ניכר בהעדר פיגומים חיצוניים (למשל, לחצים פרץ 3400 מ"מ כספית לעומת 1600 מ"מ כספית עבור ורידים saphenous אדם) 12. למרות מבוססי תאים ורקמות כלי דם התערוכה צפיפות התאים שיפור חוזק מכני, שיטות ייצור העדכניים ביותר (כגון "הנדסה גיליונות מבוסס" 3,4,12 או "bioprinting" 5,13) לדרוש תקופות תרבות ענפה (> 3 חודשים) או ציוד מיוחד לבניית רקמות 3D. תאים שמקורם ברקמה טבעת ספידod המתואר כאן מאפשר מהירות הסלולר הרכבה עצמית ליצירת חזקים בונה רקמת 3D בתוך פרק זמן קצר ללא שימוש בציוד מיוחד.
פרוטוקול זה מפרט את ההליך שפיתחנו כדי ליצור 2 מ"מ קוטר פנימי חולדה חלקה שריר תאים שמקורם ברקמה טבעות. בדוגמה הנוכחית, הטבעות היו בתרבית רקמה במשך 7 ימים (בתרבית אז עבור 7 ימים נוספים לאיחוי טבעת היווצרות צינור). עם זאת, 2 עכברוש מ"מ (אדם) וחלק תא טבעות שרירים ניתן להסיר את בארות והם מלוכדת מספיק לטיפול (למשל, על העברת צינורות סיליקון) מוקדם ככל שיום אחד לאחר זריעת התאים. בנוסף, טבעות רקמות חזקים עם קוטר פנימי משתנה (2, 4 ו 6 מ"מ) ניתן ליצור בשיטה זו פשוט על ידי שינוי בקוטר הודעה של עובש פוליקרבונט המקורי. 8 אנחנו גם שונה לאחרונה את עיצוב תבנית פוליקרבונט כדי לאפשר five 2 זריעת מ"מ בארות להיות יצוק יחידה רב גם agarose קאמרית, אשרמשתמשת פחות PDMS ו agarose, ומתאים באחד היטב צלחת 6-באר (מידע לא מוצג). שינויים בקוטר בהודעה, רוחב של זריעת הבאר, רדיוס העקמומיות של התחתון מעוגל, במספר בארות זריעה, או את העומק של בארות זריעת כולם יכולים להיות שונה פשוט על ידי שינוי מפרטים בקובץ ה-CAD עבור CNC עיבוד של עובש פוליקרבונט. לבסוף, עובש יחיד פוליקרבונט יכול לשמש כדי לפברק מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS, וכל תבנית PDMS ניתן לנקות, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר עשרות פעמים.
בנוסף לשינוי גודל הטבעות רקמות, עשינו טבעות מהרבה סוגי תאים שונים, כולל: SMCs עכברוש הראשי (יישומים סלולריים, R354-05), אדם יסודי SMCs לב כלילית (Lonza, CC-2583), האדם העיקרי fibroblasts עורי 11 (מתנה נדיבה של סיכות ד"ר ג'ורג', WPI המחלקה להנדסה ביורפואית), ריאות fibroblasts חולדה (RFL-6, ATCC CCL-192), וכן בתאי גזע mesenchymal (Lonza, PT-2501). כל אחד מסוגי אגרגטים תא חוזים סביב שנכתבו למרכז כדי ליצור טבעות רקמות; אף ארגון הסלולר, הרכב ECM, תכונות מכניות של מבנים משתנים לכל סוג תא. הפרמטרים זריעת לכל סוג תא צריכה להיקבע באופן אמפירי מבוסס על גודל התאים ואת יכולתם לצבור. לכן, בעוד המערכת של יצירת תאים שמקורם ברקמה טבעות הוא מאוד תכליתי, פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות להיווצרות רקמת אופטימלי עם סוגי תאים שונים.
טבעת הגיאומטריה רקמה מקלה טעינת הערכה קלה של תכונות החומר על ידי בדיקת רקמות מתיחה uniaxial, כמתואר. יש גם תקדים משמעותי באמצעות כלי דם מגזרים טבעת למדוד התכווצות כלי הדם ותפקוד פיזיולוגי. מחקרים ראשוניים מצביעים על תאים שמקורם ברקמה טבעות יכול להיות מותקן על מכשיר myograph חוט למדידת היענות תרופתי ודור התכווצות כוח (מידע לא מוצג). בסך הכל, את היכולת לייצר במהירות עצמית התאספו טבעות תא לניתוח היסטולוגית, מכני, פיזיולוגי, ביוכימי ו מציע כלי חדש רב עוצמה זה עשוי להיות שימושי עבור מודלים מבנה רקמות תפקוד כלי הדם ועל בריאות ומחלה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים בתודה ניל Whitehouse (WPI, חנות היגינס Machine) על עזרתו עם מכונות CNC. בנוסף, אנו רוצים להודות אדריאנה הרה (WPI מחשוב ותקשורת מרכז) על עזרתה עם MATLAB תכנות, כמו גם קייט ומשקאות ויוסף Cotnoir (WPI האקדמית Technology Center) לקבלת סיוע עם Camtasia. סופי בורק Jacleen בקר (WPI האקדמית Technology Center) סיפקה קטעי וידאו משלים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R15 HL097332), את בית הספר לרפואה UMass-WPI מחקר פיילוט יוזמת, איגוד הלב האמריקאי (מלגת מחקר לתואר ראשון JZH), ואת המכון הפוליטכני וורצ'סטר (מחקר לתואר ראשון קיץ לידידות JZH ומוסדיים סטארט כספים MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
