Summary
توضح هذه المقالة طريقة لخلق تنوعا حلقات نسيج الخلايا المشتقة من قبل الخلوية التجمع المصير. خلايا العضلات الملساء في البطولة على شكل حلقة الآبار التجميعية agarose وعقد لتشكيل قوة ثلاثية الأبعاد (3D) الأنسجة في غضون 7 أيام. حلقات الأنسجة ملليمتر النطاق تؤدي إلى اختبار الميكانيكية وتكون بمثابة اللبنات لتجميع الأنسجة.
Abstract
كل عام ، مئات الآلاف من المرضى الخضوع لعملية جراحية في الشريان التاجي في الولايات المتحدة. 1 حوالي ثلث هؤلاء المرضى لم يكن لديك مناسبة السفن المانحة ذاتي بسبب تطور المرض أو الحصاد السابق. ان الهدف من هندسة الأنسجة الوعائية هي تطوير مصدر بديل مناسب لهذه الطعوم الالتفافية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندستها الأنسجة الوعائية تثبت قيمتها بوصفها كائنات حية نماذج الأوعية الدموية لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية. تم استكشاف العديد من النهج الواعدة في الأوعية الدموية والهندسة ، مع العديد من الدراسات الحديثة التي تركز على التنمية وتحليل الخلية المستندة إلى الأساليب. 2-5 وهنا ، فإننا نقدم وسيلة لتجميع الخلايا ذاتية بسرعة الى حلقات النسيج 3D التي يمكن استخدامها في المختبر لنموذج الأنسجة الوعائية.
للقيام بذلك ، يتم تعليق المصنف خلايا العضلات الملساء في قاع بئر مستديرة agarose الحلقي. خصائص غير لاصقة للسماح عشر agaroseخلايا ه لتسوية والركام والعقد حول آخر في مركز جيد لتشكيل عصابة نسيج متماسك. 6،7 هذه الحلقات يمكن أن يكون المثقف لعدة أيام قبل الحصاد لالميكانيكية والتحليل ، والفسيولوجية البيوكيميائية ، أو النسيجية. لقد أثبتنا أن هذه الحلقات نسيج الخلايا المشتقة من العائد على 100-500 قوة الشد كيلوباسكال النهائي (8) الذي تجاوز قيمة المبلغ عنها ليبني أنسجة الأوعية الدموية الأخرى هندسيا مثقف لفترات مماثلة (<30 كيلو باسكال). 9،10 نتائجنا تظهر ان الخلايا القوية لا يمكن أن يتحقق المستمدة من الأنسجة الوعائية حلقة جيل في غضون فترة زمنية قصيرة ، ويتيح الفرصة لتقييم مباشر والكمي للمساهمات من الخلايا والخلايا المشتقة من مصفوفة (CDM) لبنية الأنسجة الوعائية ووظيفتها.
Protocol
1. تصنيع خلية بذر العفن
يبدأ الطحن (أ) 1 / 2 "قطعة سميكة من البولي لإنشاء 15 ، ذهابا والقاع ، والآبار الحلقي مع مركز قطر آخر من 2 ملم. القنوات المضروب 6 ملم وعميقة واسعة 3.75 ملم. النظيفة والجافة الى القالب البولي إزالة أي حطام البلاستيك من عملية الطحن.
مزيج polydimethylsiloxane (PDMS) في نسبة 10:01 (ث / ث) من قاعدة لوكيل علاج ، ديغا لإزالة جميع فقاعات الهواء ، ويسكب على القالب البولي. ديغا مرة أخرى لإزالة أي فقاعات المتبقية ، والشفاء في الفرن عند درجة 60 لمدة 4 ساعات.
الشفاء مرة واحدة ، وإزالة القالب بعناية PDMS بواسطة تقشير ببطء بعيدا عن البولي ، ويغسل بالماء والصابون ، والأوتوكلاف. الأوتوكلاف أيضا حلا من اثنين في المئة agarose (ث / ت) الذائب في النسر Dulbecco والمتوسطة المحورة (DMEM).
مكان القالب PDMS على سطح مستو وملء مع الآغا المنصهر ارتفعت بنسبة agarose pipetting الأولى في كل من مركز القوالب آخر ، وpipetting ثم الى الفضاء من حوله. السماح لترسيخ agarose (حوالي 15 دقيقة) ، ثم عكس القالب للافراج عن agarose من PDMS. agarose خفض الفائض من حول كل من الآبار ، ووضع الآبار في 12 agarose جيدا لوحات.
2. خلية ثقافة وبذر الحلبة
إضافة خلية الإعلام الثقافة (FBS DMEM مع 10 ٪ و 1 ٪ البنسلين ستربتومايسين) حول الجزء الخارجي من العفن agarose ، من دون تغطية الجزء العلوي من القوالب. وضع لوحات في الحاضنة ، والسماح لهم لكي تتوازن لحوالي 15 دقيقة أثناء تحضير الخلايا.
في التقاء 90 ٪ ، ويعرض للتريبسين الفئران خلايا العضلات الملساء الأبهر (rSMCs) وresuspend في تركيز خلايا 5x10 6 / مل. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل من آبار agarose الحلقي ، وذلك باستخدام حركة دائرية لتطبيق الخلايا إلى كل بئر.
محتوى "> تأكد من الرفوف هي حاضنة المستوى ، ثم ضع الأطباق في الحاضنة والسماح لهم الجلوس دون عائق لمدة 24 ساعة. بورصة المتوسطة كل يومين بعد ذلك بواسطة الشفط وسائل الإعلام من حول البئر ، وإعادة ملء كل جيدا حتى agarose البئر المغمورة تماما.3. حصاد النسيج الدائري والقياسات سماكة
في ختام والثقافة ، وإزالة عصابة من العفن agarose من الانزلاق أكثر من ذلك الجزء العلوي من مركز آخر.
مخزنة مكان الخاتم في طبق بتري الصغيرة مع الفوسفات الملحي (PBS) ، ومركز العينة ، والحصول على صورة باستخدام نظام التصوير الرقمي.
استخدام برنامج تحليل الصور من أجل الكشف عن الحافة وقياس سماكة من الحلبة في 4 وظائف (أعلى ، أسفل ، اليسار واليمين) حول محيطها. حساب قيمة سمك يعني (ر) لكل حلقة الفردية ، واستخدام هذه القيمة لحساب مساحة مستعرضة(2π (ر) 2 / 2).
4. الميكانيكية اختبار الخواتم
إعداد جهاز اختبار الشد (EPS Instron 1000) في وضع أفقي. نعلق خلية تحميل 1N ± 1mN والعرف السيطرة سلك رقيق (تم إنشاؤه بواسطة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ الانحناء).
تحميل عينة الخاتم في السيطرة two أسلاك رقيقة. تمديد السيطرة حتى يتم تطبيق 5 مليون تحميل الفارغة للعينة. دخول المنطقة مستعرضة (المحسوبة من قياسات سمك) وسجل قياس طول.
قبل دورة الحلقات 8 مرات بين الحمولة الفارغة و 50 كيلو باسكال الضغط بمعدل 10 مم / دقيقة. بعد الثامنة ما قبل الدورة ، وإلى الفشل في سحب 10 مم / دقيقة. كما لوحظ عدم حدوث انخفاض في القوة بنسبة 40 ٪ من قياس إلى آخر. لكل عينة الخاتم ، وقياس الضغط الشد النهائي (UTS) ، وسلالة الفشل وحساب الحد الأقصى لمعامل الظل (MTM) من البيانات التي يحصل عليها.
5. حلقة الأنسجة كماsembly الى افتعال أنابيب الأنسجة
يتم تشكيله أصحاب أنبوب مخصص من الأقراص 5 سم مع جولة البولي القواطع مستطيلة (2 سم * 3 سم). حفر ثقوب مترابطة من خلال هذه الأقراص للسماح ثمل two أصحاب معا. الأوتوكلاف أصحاب أنبوب مخصص ، ومن ثم نقل الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وضعها في طبق بيتري فارغة.
استخدام مقص لقطع الجراحية نهايات 1.9 ملم أنابيب قطرها سيليكون بزاوية لإنشاء مشطوف الحواف ، ثم الأوتوكلاف أنابيب السيليكون. بينما يجري تعقيمها الأنابيب ، وملء طبق بيتري مع وسائل الاعلام.
إزالة الحلقات من الآبار agarose ووضعها في صحن بيتري مع وسائل الاعلام. تعقيمها مكان أنابيب السيليكون في طبق بتري نفس الرطب عليها قبل استخدامها.
استخدام ملقط لوضع نهاية مشطوف من أنبوب السيليكون في وسط الحلقة والشريحة بلطف على عصابة للأنابيب السيليكون. كرر مع العدد المرغوب فيه من ريخ ع. الشريحة يرن في اتصال مع بعضهم البعض عن طريق دفع بلطف لهم على التوالي في كلا الاتجاهين على طول الأنبوب. ويمكن استخدام هذه الطريقة لحلقات حصادها بعد يوم واحد فقط في مجال الثقافة.
مرة واحدة هي التي شنت الخواتم ، ومحاذاة أنابيب السيليكون داخل أصحاب البولي والمسمار شطري حامل معا. مكان حامل في طبق بيتري 100 ملم و 55 ملم إضافة الوسائط. تبادل وسائل الاعلام كل 3 أيام لمدة الثقافة.
لإزالة أنابيب الأنسجة ، والإفراج عن أنابيب السيليكون من صاحب البولي واستخدام ملقط لتمرير أنابيب أنسجة قبالة أنبوب السيليكون والى صحن بيتري مليئة برنامج تلفزيوني.
6. ممثل النتائج :
تجميع الخلايا عند تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح ، على شكل حلقات النسيج التي يبلغ قطرها الداخلي يساوي القطر من العفن آخر المناظرة في غضون 24 ساعة. حواف ناعمة الحلقة عادة في مظهر (وإذا الثقافةالطبعة على سطح مستو) ، هي موحدة في جميع أنحاء سماكة محيط بأكمله. الحلقات الأنسجة من السهل التعامل معها ويمكن إزالتها من آبارهم لاحقة تحليل الميكانيكية والنسيجية (انظر في Gwyther وآخرون ، 2011 8). مورفولوجيا الأنسجة الدائري ، تكوين مصفوفة ، والخواص الميكانيكية تختلف تبعا لعدد ونوع من الخلايا المصنفة.
وتظهر نتائج ممثلة من الخواتم المصنوعة من الأنسجة المختلفة أنواع الخلايا ، بذر الشروط ، وطول الثقافة في الجدول 1. عرض حلقتين من معرف مم خلق 5 rSMCs 5x10 أعلى UTS من خلق حلقات من وجهة نظرنا تنطبق حلقات مم 2 (مصنوعة من rSMCs 6.6x10 5) 8 مماثلة لخلايا الفئران ، وخلايا العضلات الملساء (hSMC) تجميعها بسهولة لتشكيل انسجة الخواتم ، والتي تحتوي على كمية كبيرة من الكولاجين بعد 14 يوما فقط في الثقافة (لا تظهر البيانات). الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة (hMSC) مجمعة أيضا وشكلت حلقات متماسكة ، ولكن لاcked القوة الميكانيكية واندلعت خلال المراحل الأولية من precycling اختبار الشد أحادي المحور.
| ن | عدد الخلايا | سمك (ملم) | طول الثقافة (أيام) | UTS (باسكال) | MTM (باسكال) | فشل سلالة (مم / مم) | |
| rSMC الخواتم | 6 | 660000 | 0.94 ± 0.12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0.50 ± 0.08 |
| rSMC الخواتم | 4 | 500000 | 0.53 ± 0.02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0.88 ± 0.05 |
| hSMC الخواتم | 3 | 750000 | 0.51 ± 0.05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0.92 ± 0.08 |
| hMSC الخواتم | 3 | 750000 | 0.40 ± 0.07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
الجدول 1. جدول يبين معالم الثقافة والخواص الميكانيكية للخواتم 2 ملم المتولدة من أنواع مختلفة من الخلايا ، وتركيزات البذر ، وفترات الثقافة.
الشكل 1 (أ) تخطيطي لعملية توليد الأنسجة الحلبة. (ب) مخصص مع البولي العفن الحلقي الآبار المضروب. بأقطار آخر المركزية هي 2 ملم. (C) PDMS القالب بعد مقشر بعيدا عن العفن البولي. (د) حلقة مجمعة الأنسجة المستنبتة في قالب agarose مع آخر 2 ملم. (E) الأنسجة قطرها اثنان ملم حلقة في برنامج تلفزيوني. أشرطة مقياس ملم 6 ملم (B ، C) و 2 = (D ، E).
الشكل 2. مؤامرة ممثل الم Ù منحنى الإجهاد والانفعالدائرة الهندسة المدنية من اختبار الشد أحادي المحور.
Discussion
مؤخرا ، كان هناك اهتمام متزايد في بناء الخلية أو "سقالة أقل" أساليب هندسة الأنسجة لمعالجة بعض أوجه القصور في النهج القائمة على سقالة هندسة الأنسجة. بالنظر إلى أن يتم إنشاء خلية الأنسجة المشتقة من الخلايا والمصفوفة التي تنتجها ، أنها تحتوي بطبيعتها كثافة الخلية أعلى من ذلك بكثير ، لا تحتوي على مواد خارجية ، ويمكن أن يكون مصنوع بالكامل من خلايا الإنسان والبروتينات. يمكن ترقيع الأوعية المصنوعة من خلايا الإنسان تحقيق القوة الميكانيكية كبيرة في غياب السقالات الخارجية (على سبيل المثال ، والضغوط تنفجر 3400 مم زئبق مقارنة مع 1600 مم زئبقي للالصافن عروق الإنسان) 12. على الرغم من خلية مقرها الأنسجة الوعائية المعرض تحسين كثافة الخلايا والقوة الميكانيكية ، وطرق تصنيع معظم الحالية (مثل "الهندسة ورقة تستند" 3،4،12 أو "bioprinting" 5،13) تتطلب ثقافة واسعة فترات (> 3 أشهر) أو المعدات المتخصصة للبناء الأنسجة 3D. الحلقة نسيج الخلايا المشتقة من ميثوصف التطوير التنظيمي هنا تمكن السريع الخلوية التجميع الذاتي لتشكيل نسيج متين يبني 3D في غضون فترة قصيرة من الزمن ، ودون استخدام معدات متخصصة.
هذا البروتوكول تفاصيل الإجراء قمنا بتطويرها لإنشاء 2 ملم الجرذان قطرها الداخلي السلس الخلايا المشتقة من حلقات العضلات الأنسجة. في المثال الحالي ، ومثقف حلقات النسيج لمدة 7 أيام (لتربيتها ثم 7 أيام إضافية للاندماج وتكوين عصابة أنبوب). ومع ذلك ، 2 ملم الجرذان (والبشر) يمكن إزالة الخلايا العضلية سلسة حلقات من الآبار ومتماسكة بما فيه الكفاية للتعامل مع (على سبيل المثال ، نقل على أنابيب السيليكون) في أقرب وقت بعد يوم واحد زرع الخلايا. بالإضافة ، يمكن إنشاء شبكات قوية مع الأنسجة الداخلية بأقطار مختلفة (2 ، 4 ، و 6 ملم) مع هذا الأسلوب ببساطة عن طريق تغيير قطر آخر من العفن البولي الأصلي. 8 ونحن أيضا في الآونة الأخيرة تعديل تصميم قوالب البولي لتمكين five 2 آبار بذر ملم من المقرر ان يلقي في غرفة واحدة متعددة agarose جيدا ، والتيويستخدم أقل PDMS agarose ، ويناسب أيضا في واحدة من لوحة 6 - جيدا (لا تظهر البيانات). تغييرات في قطر آخر ، وعرض البذر أيضا ، في دائرة نصف قطرها من انحناء أسفل مدورة ، ويمكن كل عدد من الآبار البذر ، أو عمق الآبار بذر يمكن تعديل ببساطة عن طريق تغيير المواصفات في الملف CAD لCNC بالقطع من العفن البولي. أخيرا ، يمكن استخدام قالب واحد لافتعال البولي عدد غير محدود من القوالب PDMS ، ويمكن تنظيفها كل قالب PDMS ، تعقيمها وإعادة استخدامها عشرات المرات.
بالإضافة إلى تغيير حجم الحلقات الأنسجة ، وحققنا الكثير من الخواتم من أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك : SMCs الفئران الأساسية (تطبيقات الخليوي ، R354 - 05) ، المرحلة الابتدائية الإنسان SMCs الشريان التاجي (Lonza ، CC - 2583) ، الإنسان الأساسية الجلد الليفية 11 (هدية سخية من الدبابيس الدكتور جورج WPI قسم الهندسة الطبية الحيوية) ، الرئة الليفية الفئران (إعادة الروابط العائلية - 6 ، ATCC CCL - 192) ، والخلايا الجذعية الوسيطة (Lonza ، PT-2501). كل من هذه الخلية أنواع الركام والعقود حول الوظائف مركز على شكل حلقات الأنسجة ، على الرغم من تنظيم الخلوية ، وتكوين ECM ، والخصائص الميكانيكية للبنيات تختلف عن كل نوع من الخلايا. يجب أن تكون المعلمات بذر لكل نوع من الخلايا تحدد تجريبيا على أساس حجم الخلايا وقدرتها على تجميع. لذا ، في حين أن هذا النظام خلق حلقات نسيج الخلايا المشتقة مرنة للغاية ، قد تحتاج بروتوكول تعديلات طفيفة لتكوين الأنسجة الأمثل مع أنواع مختلفة من الخلايا.
هندسة النسيج الدائري يسهل التحميل سهلة وتقييم خواص المواد الأنسجة عن طريق اختبار الشد أحادي المحور ، كما هو موضح. هناك أيضا سابقة كبيرة لاستخدام شرائح الدم حلقة السفينة لقياس تقلص الأوعية الدموية وظيفة فسيولوجية. الدراسات الأولية تشير إلى أن يمكن تركيبه حلقات نسيج الخلايا المشتقة على سلك جهاز myograph لقياس الاستجابة الدوائية ومقلص قوة جيل (لا تظهر البيانات). تماما ، والقدرة على افتعال بسرعة حلقات خلية الذاتي تجميع للتحليل النسيجي والميكانيكية والفسيولوجية والبيوكيميائية ويشير إلى وجود أداة قوية جديدة قد تكون مفيدة للبنية الأنسجة الوعائية النمذجة وظيفة في مجال الصحة والمرض.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب الامتنان نيل ايتهاوس (WPI وهيغنز صناعة الآلات) لمساعدته مع التصنيع باستخدام الحاسب الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر أدريانا هيرا (WPI الحاسبات ومركز للاتصالات) ليساعدها مع برمجة MATLAB ، وكذلك المشروبات كيت وجوزيف كوتنوير (WPI الأكاديمية مركز تقنية) للحصول على المساعدة مع كمتسا. قدمت صوفي وبورك Jacleen بيكر (WPI الأكاديمية مركز تقنية) تكميلية لقطات الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R15 HL097332) ، وبحوث الطبية UMass المدرسة التجريبية WPI المبادرة ، وجمعية القلب الأميركية (الزمالة البحثية الجامعية إلى JZH) ، ورسستر معهد البوليتكنيك (زمالة البحوث الجامعية الصيفية لJZH والمؤسسية بدء الأموال لMWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
