Summary
Denne artikkelen skisserer en allsidig metode for å skape celle-stammer vev ringer av cellulære selv-montering. Glatte muskelceller seeded inn ringformet agarose brønner samlet og kontrakt for å danne robuste tredimensjonale (3D) vev innen 7 dager. Millimeter-skala vev ringene er bidrar til mekanisk testing og fungere som byggesteiner for vev montering.
Abstract
Hvert år hundretusener av pasienter som gjennomgår koronar bypass kirurgi i USA. Gjøre 1 Omtrent en tredjedel av disse pasientene ikke har egnet autolog giver fartøy som følge av sykdomsprogresjon eller forrige innhøsting. Målet med vaskulær tissue engineering er å utvikle en egnet alternativ kilde for disse bypass grafts. I tillegg kan konstruert vaskulære vevet være verdifull som levende vaskulære modeller for å studere hjerte-og karsykdommer. Har flere lovende tilnærminger til engineering blodkar blitt utforsket, med mange nyere studier som fokuserer på utvikling og analyse av celle-baserte metoder. 2-5 Heri presenterer vi en metode for raskt selv montere celler i 3D vev ringer som kan brukes i vitro å modellere vaskulære vev.
For å gjøre dette, er suspensjoner av glatte muskelceller seeded i runde bunn ringformet agarose brønner. Den ikke-klebende egenskaper agarose tillate the celler å bosette seg, samlet og kontrakt rundt en post i midten av brønnen for å danne en sammenhengende vev ring. 6,7 Disse ringene kan dyrkes i flere dager før høsting for mekaniske, fysiologiske, biokjemiske eller histologiske analyser. Vi har vist at disse celle-stammer vev ringer yield ved 100-500 kPa ultimate strekkfasthet 8 som overstiger verdien rapportert for andre vev konstruert vaskulære konstruerer kultivert for lignende varighet (<30 kPa). 9,10 Våre resultater viser at robuste celle -avledet vascular tissue ring generasjon kan nås innen en kort tidsperiode, og tilbyr muligheten for direkte og kvantitativ vurdering av bidrag av celler og celle-avledet matrise (CDM) til vaskulære vev struktur og funksjon.
Protocol
1. Cell seeding mugg fabrikasjon
Begynn med å frese en 1 / 2 "tykt stykke polykarbonat for å lage 15, rund bunn, ringformet brønner med et senter innlegg diameter på 2 mm. Frest kanalene er 6 mm dyp og 3,75 mm bred. Rengjør og tørk polykarbonat mold til fjerne plast rusk fra fresing prosessen.
Mix polydimetylsiloksan (PDMS) på en 10:1 ratio (w / w) av base til herder, Degas å fjerne alle luftbobler, og hell på polykarbonat mold. Degas igjen for å fjerne eventuelle gjenværende bobler, og kur i ovnen ved 60 ° C i 4 timer.
Når herdet, fjerner den PDMS mal ved sakte skrelle den bort fra polykarbonat, vask med såpe og vann, og autoklav. Også autoklav en løsning av to prosent agarose (w / v) oppløst i Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM).
Plasser PDMS malen på en jevn overflate og fyll med smeltet AGA steg med første pipettere agarose i hver av senteret innlegget formene, og deretter pipettering inn i rommet rundt det. La agarose å stivne (ca. 15 minutter), deretter snu mugg å frigjøre agarose fra PDMS. Skjær overflødig agarose fra rundt hver av brønnene, og plasser agarose brønner inn i 12-brønn plater.
2. Cellekultur og ring seeding
Legg cellekultur media (DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) rundt utsiden av agarose mold, uten å dekke toppen av muggsopp. Plasser platene i kuvøse og tillate dem til stabilisering i ca 15 minutter mens du forbereder cellene.
At 90% samløpet, trypsinize rotte aorta glatte muskelceller (rSMCs) og resuspender ved en konsentrasjon på 5x10 6 celler / ml. Pipetter 100 mL cellesuspensjon i hver av de ringformede agarose brønner, med sirkelbevegelser å søke celler til hver brønn.
innhold "> Pass er sikker inkubator hyller nivå, så plasserer platene i kuvøse og tillate dem å sitte uforstyrret i 24 timer. Exchange-medium hver to dager etterpå ved å aspirere media fra rundt brønnen, og re-fylling hver brønn til agarose Brønnen er helt nedsenket.3. Tissue ring høsting og tykkelse målinger
Ved avslutningen av kultur, fjerne ringen fra agarose mugg ved å skyve det over toppen av senteret innlegget.
Plasser ringen i en liten petriskål med fosfatbufret saltvann (PBS), senter prøven, og få et bilde ved hjelp av en digital imaging system.
Bruk en bildeanalyse program for kantdeteksjon og måle tykkelsen på ringen i 4 posisjoner (topp, bunn, venstre og høyre) rundt omkretsen sin. Beregn gjennomsnittlig tykkelse verdi (t) for hver enkelt ring, og bruke denne verdien til å beregne tverrsnitt(2π (t / 2) 2).
Fire. Mekanisk testing av ringer
Sett opp strekk testing maskinen (Instron EPS 1000) i horisontal stilling. Fest en 1N ± 1mN last celle og tilpassede tynn tråd grep (opprettet av bøying rustfritt ståltråd).
Monter ringen prøven på to tynne ledningen håndtak. Utvid grep inntil en 5 mN tara belastning påføres prøven. Skriv inn tverrsnittsareal (regnet ut fra tykkelse målinger) og registrere gauge lengde.
Pre-syklus ringene 8 ganger mellom tara lasten og 50 kPa stresset med en hastighet på 10 mm / min. Etter den åttende pre-syklus, dra til svikt ved 10 mm / min. Svikt er kjent som en nedgang i kraft med 40% fra en måling til den neste. For hver ring prøve, måle ultimate strekk stress (UTS) og feil belastning og beregne maksimalt tangent modulus (MTM) fra det oppkjøpte data.
5. Tissue ring somsembly å dikte vev rør
Custom tube holdere er maskinert fra runde 5 cm polykarbonat disker med rektangulære utsparinger (2 cm x 3 cm). Bor gjengede hull gjennom disse diskene å tillate to innehavere til å være skrudd sammen. Autoclave skikken tube holders, og deretter overføre til biosikkerhet kabinettet og plasser i en tom petriskål.
Bruk kirurgisk saks til å klippe endene på 1,9 mm diameter silikon rør på skrå for å lage skrå kanter, og deretter autoklaveres silikon rør. Mens rørene blir autoklaveres, fylle en petriskål med media.
Ta ringene fra agarose brønner og plassere dem i petriskål med media. Plasser autoklaveres silikon rør i samme petriskål å fukte dem før bruk.
Bruk pinsett til å plassere en beveled slutten av en silikon tube inn i sentrum av en ring og forsiktig skyve ringen på silikonslanger. Gjenta med ønsket antall riNGS. Skyv ringene i kontakt med hverandre ved å forsiktig skyve dem suksessivt i begge retninger langs røret. Denne metoden kan brukes for ringer høstes etter bare én dag i kultur.
Når ringene er montert, sluttar silikon rør i polykarbonat holdere og skru de to delene av holderen sammen. Plasser holderen i en 100 mm petriskål og tilsett 55 ml media. Utveksling media hver 3 dager for varigheten av kultur.
For å fjerne vev rør, slipp silikon rør fra polykarbonat holderen og bruk tang til å skyve vevet rør av silikon tube og inn i en petriskål fylt med PBS.
Seks. Representant Resultater:
Når protokollen er utført riktig, samlet celler til å danne vev ringer med en indre diameter lik diameter tilsvarende mugg post innen 24 timer. Ringen Kantene er vanligvis glatt i utseende og (hvis kulturelted på et jevnt underlag), er jevn i tykkelse rundt hele omkretsen. Vevet ringene er lett å håndtere og kan fjernes fra sine brønner for etterfølgende mekanisk og histologiske analyser (se i Gwyther et al., 2011 8). Tissue ring morfologi, matrise sammensetning og mekaniske egenskaper varierer avhengig av antall og type celler seeded.
Representant resultater fra vev ringene er laget av ulike celletyper, såing forhold, og kultur lengde er vist i tabell 1. To mm ID ringer opprettet fra 5x10 5 rSMCs utstilt en høyere UTS enn ringene opprettet fra vår tidligere publiserte 2 mm ringer (laget av 6.6x10 5 rSMCs). Åtte likhet med rotte celler, menneskelige glatte muskelceller (hSMC) lett samles for å danne vev ringer, som inneholdt en stor mengde kollagen etter bare 14 dager i kultur (data ikke vist). Menneskelige stamceller (hMSC) også samlet og dannet sammenhengende ringer, men lacked mekanisk styrke og brakk under den første precycling fasene av uniaxial strekk testing.
| n | Celle nummer | Tykkelse (mm) | Lengde på kultur (dager) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Unnlatelse belastning (mm / mm) | |
| rSMC ringer | 6 | 660 000 | 0.94 ± 0.12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0.50 ± 0.08 |
| rSMC ringer | 4 | 500 000 | 0.53 ± 0.02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0.88 ± 0.05 |
| hSMC ringer | 3 | 750 000 | 0.51 ± 0.05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0.92 ± 0.08 |
| hMSC ringer | 3 | 750 000 | 0.40 ± 0.07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabell 1. Tabell som viser kulturen parametere og mekaniske egenskaper av 2 mm ringer genereres fra forskjellige celletyper, såing konsentrasjoner, og kultur varighet.
Figur 1. (A) Skjematisk av vevet ringen generasjon prosess. (B) Custom polykarbonat formen med freste ringformet brønner. Sentrale post diameter er 2 mm. (C) PDMS mal etter at det ble skrellet vekk fra polykarbonat mold. (D) Samlet vev ring dyrket i en agarose formen med en 2 mm innlegg. (E) To mm diameter vevet ring i PBS. Skala barer = 6 mm (B, C) og 2 mm (D, E).
Figur 2. Representative tomt av stress-belastning kurve Produtet fra uniaxial strekk testing.
Discussion
Nylig har det vært en økt interesse i celle-basert eller "stillas-mindre" tissue engineering metoder for å løse noen av begrensningene i stillas-baserte tissue engineering tilnærminger. Gitt at celle-avledet vev er opprettet fra celler og matrisen de produserer, de iboende inneholder mye høyere celle tettheter, inneholder ingen eksogene materialer, og kan gjøres helt fra humane celler og proteiner. Vaskulær grafts laget av menneskeceller kan oppnå betydelige mekaniske styrken i fravær av eksogene stillasene (f.eks briste presset 3400 mmHg i forhold til 1600 mmHg for human saphenous årer) 12. Selv cellebasert vaskulære vev utstillingen forbedret celle tetthet og mekanisk styrke, mest aktuelle fabrikasjon metoder (for eksempel "sheet-basert engineering" 3,4,12 eller "bioprinting" 5,13) krever omfattende kultur perioder (> 3 måneder) eller spesialisert utstyr for 3D vev konstruksjon. Cellen-avledet vev ring method beskrevet her muliggjør rask cellular self-forsamlingen til å danne robuste 3D vev konstruerer innen kort tid og uten bruk av spesialisert utstyr.
Denne protokollen beskriver prosedyren vi utviklet for å skape 2 mm indre diameter rotte glatt muskelcelle-avledet vev ringer. I dagens eksempel, var vev ringer dyrket i 7 dager (da kultivert for en ytterligere 7 dager for ring fusion og tube dannelse). Men 2 mm rotte (og menneskelige) glatt muskelcelle ringer kan fjernes fra brønnene og er helhetlig nok for håndtering (f.eks overføre til silikon rør) så tidlig som en dag etter celle seeding. I tillegg kan robust vev ringer med ulik indre diameter (2, 4 og 6 mm) lages med denne metoden ved å endre innlegget diameter av den opprinnelige polykarbonat mugg. 8. Vi har også nylig endret polykarbonat mold design for å muliggjøre fem 2 mm seeding brønner for å bli kastet i en enkelt multi-brønn agarose kammer, sombruker mindre PDMS og agarose, og passer i en brønn i en 6-brønns plate (data ikke vist). Endringer i innlegget diameter, bredden på seeding vel, krumningsradius av avrundet bunn, kan antall seeding brønner, eller dybden på seeding brønnene alle endres bare ved å endre spesifikasjonene i CAD-filen for CNC maskinering av polykarbonat mold. Endelig kan et enkelt polykarbonat mugg brukes til å dikte et ubegrenset antall PDMS maler, og hver PDMS mal kan rengjøres, autoklaveres og gjenbrukt dusinvis av ganger.
I tillegg til å endre størrelsen på vev ringer, har vi gjort ringer fra mange forskjellige celletyper, inkludert: primær rat SMCs (Cell Applications, R354-05), primær human coronary artery SMCs (Lonza, CC-2583), primær menneskelig dermale fibroblaster 11 (generøse gaven av Dr. George Pins, WPI Dept. of Biomedical Engineering), rottelunge fibroblaster (RFL-6, ATCC CCL-192), og stamceller (Lonza, PT-2501). Hver av disse celletyper aggregater og kontrakter rundt sentrum innlegg for å danne vev ringer, selv om den cellulære organisering, ECM sammensetning og mekaniske egenskaper av konstruerer variere for hver celletype. Den seeding parametere for hver celle type må empirisk fastsettes basert på størrelsen av cellene og deres evne til å aggregere. Derfor, mens dette systemet for å skape celle-stammer vev ringer er svært allsidig, kan protokollen trenge små justeringer for optimal vev formasjon med forskjellige celletyper.
Tissue ring geometri forenkler lasting og vurdering av vev materialegenskaper ved uniaxial strekk testing, som beskrevet. Det er også betydelig presedens for bruk av blod fartøy ring segmenter for å måle vaskulær kontraksjon og fysiologiske funksjon. Foreløpige studier tyder på at celle-stammer vev ringene kan monteres på en wire myograph enhet for måling av farmakologisk respons ogkontraktile kraft generasjon (data ikke vist). Samlet foreslår evnen til å raskt dikte selv-montert cell ringer for histologiske, mekanisk, fysiologiske og biokjemiske analyser et kraftig nytt verktøy som kan være nyttige for modellering vaskulære vev struktur og funksjon i helse og sykdom.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) for hans hjelp med CNC maskinering. I tillegg ønsker vi å takke Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) for hennes hjelp med MATLAB programmering, samt Kate drikke og Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) for å få hjelp med Camtasia. Sophie Burke og Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) gitt supplerende videoopptak. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (R15 HL097332), den UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (undergraduate stipendiatstilling til JZH) og Worcester Polytechnic Institute (Sommer Undergraduate Research Fellowship til JZH og institusjonelle oppstart midler til MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
