Summary
이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.
Abstract
매년 환자의 수천 수백 미국의 관상 동맥 바이패스 수술을 받고있다. 이들 환자 중 1 약 1 세 번째 질병의 진행 또는 이전 수확에 의한 적합한 autologous 기증자 선박이 없습니다. 혈관 조직 공학의 목적은 이러한 바이패스 이식에 적합한 대체 소스를 개발하는 것입니다. 또한, 설계된 혈관 조직이 심장 질환을 공부 혈관 모델을 생활로 귀중한 증명할 수 있습니다. 엔지니어링 혈관에 여러 약속 접근이 많은 최근의 연구는 셀 기반 방법의 개발과 분석에 초점을 함께 살펴왔다. 2-5 계약은, 우리는에서 사용할 수있는 3 차원 조직 반지에 신속하게 자기 조립 전지하는 방법을 제시 체외은 혈관 조직을 모델로.
이렇게하려면, 평활근 세포의 정지는 둥근 바닥 환상 아가로 오스 우물에 씨앗을 품고있다. 아가로 오스의 비 접착 특성은 일 수전자 세포가 응집 조직 고리를 형성하기 위해 우물의 중심에 게시 주위, 집계 및 계약을 해결합니다. 6,7이 반지는 이전 기계, 생리, 생화학, 또는 histological 분석을 위해 수확 몇 일 동안 교양 수 있습니다. 우리는이 세포 - 파생 조직 반지 비슷한 기간이 (<30 kPa)에 대한 교양 다른 조직 공학 혈관 구조에 대해 보고된 값을 초과 100-500 kPa 최고의 인장 강도 8시 항복하는 것으로 나타났습니다. 9,10 우리의 결과는 강력한 세포를 입증 - 파생 혈관 조직 고리 생성은 짧은 기간 내에 달성하고, 세포 및 혈관 조직 구조와 기능 세포 파생 매트릭스 (CDM)의 기여의 직접적이고 양적 평가에 대한 기회를 제공하실 수 있습니다.
Protocol
1. 세포 시딩 금형 제조
2mm의 중심지 포스트 직경 15, 둥근 바닥, 환상 우물을 만드는 폴리 카보 네이트의 1 / 2 "두께 부분을 밀링하여 시작합니다. 가공된 채널은 6 깊은 mm 넓은 3.75 mm입니다. 클린 및 폴리 카보 네이트 몰드를 건조 밀링 과정에서 모든 플라스틱 파편을 제거합니다.
모든 공기 방울을 제거하고 폴리 카보 네이트 몰드에 부어으로 치료 대리인, 가스를 제거하다하는 기지의 10시 1분 비율 (W / W)에 혼합 polydimethylsiloxane (PDMS). 가스를 제거하다 다시 남아있는 거품을 제거하고 4 시간 동안 60 ° C에서 오븐에 치료.
일단 치료, 조심스럽게 천천히 폴리 카보 네이트에서 물러나고하여 PDMS 템플릿을 제거 비누와 물로 씻어, 그리고 압력솥. 또한 2퍼센트 아가로 오스 (W / V) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 용해의 솔루션을 압력솥.
수준의 표면에 PDMS 템플릿을 놓고 용융 아가와 함께 기입 중앙 게시물 금형의 각에 첫번째 pipetting 아가로 오스 상승하고 주변 공간에 pipetting. 아가로 오스가 (약 15 분) 응고하도록 허용 후 PDMS에서 아가로 오스를 공개 금형을 반전. 우물의 각 주위에서 초과 아가로 오스 잘라, 그리고 12 - 잘 접시에 아가로 오스 우물을 넣으십시오.
2. 세포 배양 및 링 시딩
금형의 상단을 포함하지 않고, 아가로 오스 금형의 외부 주위 세포 문화 미디어 (10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM) 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다하고 세포를 준비하는 동안 그들이 약 15 분 동안 평형 수 있습니다.
90 % 합류에서 쥐의 대동맥 평활근 세포 (rSMCs)을 trypsinize 및 5x10 6 세포 / ML의 농도에 resuspend. 각 잘하는 세포를 적용하는 원운동을 사용하여 고리 모양의 아가로 오스 우물의 각으로 세포 현탁액의 피펫 100 μL.
컨텐츠 "> 있는지 인큐베이터 선반이 수준 아르 확인 후 인큐베이터에서 접시를 배치하고 24 시간 동안 그대로 앉아하실 수 있습니다. 교류 매체는 이틀 이후 잘 주위에서 미디어를 aspirating하여 다시 작성 각 잘 때까지 아가로 오스는 잘 완전 침수입니다.3. 조직 링 수확 및 두께 측정
문화의 결론에서, 중앙 게시물의 맨 위에 그것을 슬라이딩하여 아가로 오스 금형에서 반지를 제거합니다.
인산염과 작은 배양 접시에있는 반지를 놓고는 식염수 (PBS), 센터에게 샘플을 버퍼 및 디지털 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득.
에지 검출을위한 이미지 분석 프로그램을 사용하고 둘레 약 4 위치 (상단, 하단, 왼쪽 및 오른쪽)에있는 고리의 두께를 측정합니다. 각 반지에 대한 의미 두께 값 (t)를 계산하고, 단면적을 계산하려면이 값을 사용(2π (T / 2) 2).
4. 반지의 기계적 시험
수평 위치에 인장 시험기를 (Instron EPS 1000)를 설정합니다. 1N ± 1mN로드 셀 및 사용자 지정 얇은 와이어를 그립 (스테인레스 스틸 와이어를 절곡하여 만든) 연결합니다.
두 얇은 와이어 그립에있는 반지 샘플을 탑재합니다. 5 MN 살갈퀴로드가 샘플에 적용 때까지 그립를 확장합니다. 단면적을 (두께 측정으로부터 계산)를 입력하고 게이지 길이를 기록합니다.
사전 사이클 8 배 10mm / 분 속도로 살갈퀴 하중 50 kPa 응력 사이의 반지. 미리주기 여덟째 후, 10mm / 분 실패로 당기십시오. 실패 한 측정에서 다음 40 % 강제의 감소로 기록됩니다. 각 반지 샘플은 궁극적인 인장 응력 (UTS)와 파괴 변형도를 측정하고 취득한 데이터의 최대 접선 계수 (MTM)를 계산합니다.
5. 조직 링으로sembly 조직 튜브를 조작하는
사용자 정의 튜브 소유자는 직사각형 단편 (2cm × 3 ㎝)과 원형 5cm 폴리 카보 네이트 디스크에서 가공됩니다. 이 홀더가 함께 끝장 수 있도록이 디스크를 통해 스레드 구멍을 드릴. 사용자 정의 튜브 홀더를 압력솥 다음 biosafety 캐비닛과 빈 배양 접시에있는 곳으로 전송할 수 있습니다.
beveled 가장자리를 만들 수있는 각도로 1.9 mm 직경의 실리콘 튜브의 끝부분을 잘라 다음 실리콘 튜브를 압력솥에 외과 가위를 사용합니다. 튜브가 autoclaved되고있는 동안, 미디어 페트리 접시를 입력하십시오.
아가로 오스 우물에서 반지를 제거하고 미디어와 페트리 접시에 놓으십시오. 장소 사용하기 전에 그들을 엿먹일 수 같은 배양 접시에있는 실리콘 튜브를 autoclaved.
고리의 중심에 실리콘 튜브의 끝부분을 beveled 장소 부드럽게 실리콘 튜브에 반지를 슬라이드 집게를 사용하십시오. RI의 원하는 번호와 반복ngs. 부드럽게 튜브를 따라 양쪽 방향으로 연속 그들을 밀어 서로 접촉으로 반지를 슬라이드. 이 방법은 문화의 한 다음날 수확 고리 사용할 수 있습니다.
일단 고리는 폴리 카보 네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 함께 홀더의 두 부분을 나사, 탑재하고 있습니다. 100mm 배양 접시에있는 홀더를 놓고 55 ML 미디어를 추가합니다. 문화의 기간 동안 교환 언론 매 3 일.
조직 튜브를 제거하려면, 폴리 카보 네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 출시하고 실리콘 튜브를 끄고 PBS 가득한 페트리 접시에 조직 튜브 슬라이드 집게를 사용합니다.
6. 대표 결과 :
프로토콜이 올바르게 수행되면, 세포는 24 시간 이내에 대응하는 금형 게시물의 직경과 동일 내부 직경 조직 반지를 형성 집계. 링 가장자리는 보통 외모에 부드럽고 (있다면 cultur수준의 표면에 에드), 전체 원주 주위의 두께를 균일하고 있습니다. 조직 반지는 취급하기 쉽고 후속 기계 및 histological 분석을 위해 자신의 우물 (Gwyther 외에 참조하십시오. 2011 년 8)에서 제거할 수 있습니다. 조직 링 형태, 매트릭스 구성과 기계적 성질이 씨앗 세포의 수와 유형에 따라 다릅니다.
, 세포 유형을 다양한 조건을 퍼뜨리고, 문화의 길이로 만들어진 조직 링의 대표 결과는 표 1에 표시됩니다. 5x10 5 rSMCs에서 만든 두 mm ID의 고리는 우리 이전에 출판 2mm 고리 (6.6x10 5 rSMCs로 만든)에서 만든 반지보다 높은 UTS를 전시. 쥐의 세포, 인간의 평활근 세포 (hSMC)와 마찬가지로 8 즉시 조직을 형성하는 총체적 문화의 겨우 14 일 (데이터가 표시되지 않음) 후 콜라겐의 큰 금액을 포함 반지. 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)도 집계와 응집 고리를 형성하지만, LAuniaxial 인장 시험의 초기 precycling의 단계에서 cked 기계적 강도와 부러 졌어요.
| N | 핸드폰 번호 | 두께 (mm) | 문화의 길이 (일) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | 파괴 변형 (㎜ / ㎜) | |
| rSMC 반지 | 6 | 660,000 | 0.94 ± 0.12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0.50 ± 0.08 |
| rSMC 반지 | 4 | 500,000 | 0.53 ± 0.02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0.88 ± 0.05 |
| hSMC 반지 | 3 | 750,000 | 0.51 ± 0.05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0.92 ± 0.08 |
| hMSC 반지 | 3 | 750,000 | 0.40 ± 0.07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
표 1. 문화 매개 변수와 다른 세포 유형, 시딩 농도, 그리고 문화에서 발생 기간이 2mm 반지의 기계적 성질을 보여주는 표.
그림 1. 조직 링 생성 과정 (A) 도식. 가공된 환상 웰스와 (B) 정의 폴리 카보 네이트 몰드. 중앙 포스트 지름은 2mm입니다. 그것은 폴리 카보 네이트 몰드 멀리 벗겨 이후 (C) PDMS 템플릿. (D) 집계 조직 반지는 2mm 포스트와 아가로 오스의 금형에 교양. PBS에서 (E) 2 mm 직경 조직 반지. 스케일 바 = 6mm (B, C)와 2mm (D, E).
그림 2. 응력 - 변형 곡선 produ 대표 플롯uniaxial 인장 시험에서 뭐하는거야.
Discussion
최근 셀 기반 또는 "비계 - 이하"조직 공학 방법 발판 기반 조직 공학 접근의 한계 중 일부를 주소에 관심이 증가되었습니다. 셀 - 파생 조직이 세포에서 생성되고 그들이 생산 매트릭스가, 그들은 본질적으로,보다 높은 세포 밀도를 포함하는 더 외인성 물질을 포함하지 않으며, 인간의 세포와 단백질에서 완전히 만들 수있는 것으로 감안할 때. 인간의 세포로 만든 혈관 이식은 외인성 공사장 공중 발판의 부재 (예 : 버스트 압력 인간 saphenous 정맥을위한 1600 mmHg에 비해 3400 mmHg) 12 상당한 기계적 강도를 얻을 수 있습니다. 셀 기반의 혈관 조직이 개선 세포 밀도와 기계적 강도, 최신 제조 방법 (예 : "시트 기반 엔지니어링"3,4,12 또는 "bioprinting"5,13 등) 전시 있지만 광범위한 문화 기간 (> 3 개월) 필요하거나 3D 조직 건설을위한 전문 장비. 셀 - 파생 조직 링 메스OD 시간이 짧은 기간 내에 그리고 전문 장비를 사용하지 않고 강력한 3D 조직 구조를 형성 급속한 세포 자기 조립을 가능하게 여기 설명했다.
이 프로토콜은 자세한 내용은 우리가 2mm 내경 쥐 평활근 세포 - 파생 조직 반지를 작성하기 위해 개발된 프로 시저를. 현재 예제에서는, 조직 링은 7 일 (다음 링 융합 및 튜브 형성을위한 추가 7 일 동안 교양)에 대한 교양되었습니다. 그러나, 세포 시딩 후 하루가 일찍 2mm의 쥐 (인간) 평활근 세포 고리가 우물에서 제거 (실리콘 튜브에 예를 들어, 전송)을 처리하기에 충분한 응집 아르 수 있습니다. 또한, 내부 지름 (2, 4 및 6mm)을 변화와 함께 강력한 조직 고리는 단순히 원래의 폴리 카보 네이트 몰드의 게시물 직경을 변경하여이 방법으로 만들 수 있습니다. 여덟 우리는 또한 최근에 오 2를 사용하는 폴리 카보 네이트 금형 설계를 수정 하나의 멀티 - 글쎄 아가로 오스 챔버에서 주조 수 mm의 시딩의 우물, 어떤PDMS와 아가로 오스 이하를 사용하고, 6 자 플레이트 (데이터가 표시되지 않음) 중 하나에 잘 맞는 데요. 포스트 직경의 변화는 잘 시딩의 너비가 둥근 하단의 곡률 반경은 시딩의 우물, 또는 시딩의 우물의 깊이의 숫자는 모두 CNC를위한 CAD 파일의 규격을 변경하여 간단하게 수정할 수 있습니다 폴리 카보 네이트 금형의 가공. 마지막으로, 하나의 폴리 카보 네이트 몰드는 PDMS 템플릿 무제한를 조작하는 데 사용할 수 있으며 각 PDMS 템플릿 청소 수 autoclaved와 수십 번 재사용.
기본 쥐 SMCs (셀 응용 프로그램, R354 - 05), 기본 인간의 관상 동맥 SMCs (Lonza, CC - 2583), 기본 인간 : 조직 반지의 크기를 변경하는 것 외에도, 우리는 다음을 포함한 여러 세포 유형에서 반지를 만들었습니다 피부 섬유아 세포 11 조 (박사 조지 핀의 관대한 선물, 의생명 공학의 WPI 공학과), 쥐의 폐 섬유아 세포 (RFL - 6, ATCC CCL - 192) 및 mesenchymal 줄기 세포 (Lonza, 태평양 표준시-2501). 이러한 셀 형식 집계 및 조직 고리를 형성하는 중심 포스트 주위에 계약의 각, 세포 조직, ECM 구성 및 구조의 기계적 물성은 각 세포 유형에 따라 다를 있지만. 각 세포 유형에 대한 시딩 매개 변수는 경험적으로 세포의 크기와 능력 총계에 기초하여 결정되어야합니다. 셀 - 파생 조직 반지를 만드는이 시스템은 매우 다양한 반면 따라서, 프로토콜은 서로 다른 세포 유형과 최적의 조직 형성에 대한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다.
설명한대로 조직 링 기하학은 uniaxial 인장 시험에 의해 조직 재료 특성을 쉽게 로딩 및 평가를 용이하게합니다. 혈관 수축과 생리 기능을 측정하기 위해 혈관 링 세그먼트를 사용하기위한 실질적인 전례도있다. 예비 연구는 세포 - 파생 조직 반지는 약리 반응의 측정을위한 와이어 myograph 장치에 설치할 수 있습니다함을수축성 힘 세대 (데이터가 표시되지 않음). 모두, 빠르게, histological 기계적, 생리적 및 생화 학적 분석을 위해 자기 조립 셀 반지를 조작하는 능력은 건강과 질병에 혈관 조직 구조와 기능을 모델링하는 데 유용할 수 있습니다 강력한 새로운 도구를 제안합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 CNC 가공과 그의 도움 닐 Whitehouse (WPI, 히긴스의 기계 공장)을 인정합니다. 또한, 우리는 Camtasia와 도움을 MATLAB 프로그래밍뿐만 아니라, 케이트 음료와 요셉 Cotnoir (WPI 학술 기술 센터)와 그녀의 도움 아드리 아나 헤라를 (WPI 컴퓨팅 및 커뮤니케이션 센터) 감사드립니다. 소피 벅 및 Jacleen 베커 (WPI 학술 기술 센터)는 보충 영상을 제공했습니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R15 HL097332), UMass 의과 대학 - WPI 파일럿 연구 이니셔티브, 미국 심장 협회 (JZH에 학부 연구 활동) 및 우스터 폴리 테크닉 대학 (JZH 및 기관에 여름 대학의 연구 활동에 의해 투자되었다 ) MWR에 자금 업을 시작합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
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